Construction of a trivalent candidate Shigella vaccine strain with host-vector balanced-lethal system

A trivalent live Shigella vaccine candidate FSD01 against S. flexneri 2a, S. sonnei and S. dysen-teriae I was constructed. This candidate strain was based on the S. flexneri 2a vaccine T32. By homologous recombi-nation exchange, the chromosomal asd gene of T32 was site-specifically inactivated, resulting in the strain unable to grow normally in LB broth, while another asd gene of S. mutans was employed to construct an Asd complementary vector. This combination of asd ’host/ Asd+ vector formed a balanced-lethal expression system in T32 strain. By use of this system, two important protective antigen genes coding for S. sonnei Form I antigen and Shiga toxin B subunit were cloned and expressed in T32, which led to the construction of trivalent candidate vaccine FSD01. Experimental results showed that this strain was genetically stable, but its recombinant plasmid was non-resistant. Moreover, it was able to effectively express trivalent antigens in one host and induce protective responses in mice against

回交改良家蚕性连锁平衡致死系的研究

将家蚕性连锁平衡致死系与优良常规品种杂交后 ,F1代自交 ,再与平衡致死系回交 ,然后利用标记基因选择 ,可以把常规品种的血缘导入平衡致死系 ,改良其经济性状。本文对这一方法进行了研究 。

家蚕性连锁平衡致死系性别控制基因转移方法研究

利用家蚕性连锁平衡致死系可实现专养雄蚕的目的。但现行蚕品种缺乏平衡致死系的性别控制基因 ,不能人为控制性别。本文通过一个生物实例 ,介绍一个把家蚕性连锁平衡致死的性别控制基因导入现行品种的方法 ,使现行品种也具有性别控制能力 。

新型生长抑素原核表达质粒的构建及表达鉴定

将生长抑素(SS)与乙肝表面抗原(S)融合基因插入平衡致死系统原核表达质粒pYA3493中,转化至缺失asd基因的减毒猪霍乱沙门氏菌C500,经酶切、测序筛选得到非抗性的目的克隆,命名为pYA-SS。应用SDS-PAGE和Western blotting技术分离并检测融合蛋白在宿主菌中的表达活性。结果表明,本试验构建的非抗性筛选生长抑素原核表达质粒可以在宿主菌C500中稳定、正确表达。此研究为开发新型、高效、安全的促生长疫苗提供了可靠的研究材料。

利用性连锁平衡致死系进行雄蚕品种选育的方法研究

雄蚕生命力较雌蚕强,食桑少,叶丝转化率和茧层率高,雄蚕丝的纤度细,丝质优,容易缫制高品位的生丝。专养雄蚕是蚕业未来发展的主要方向,利用性连锁平衡致死基因控制蚕的性别以实现专养雄蚕是一项高新技术,已达到实用化水平。本文在总结实际操作经验的基础上,对利用性连锁平衡致死系进行雄蚕品种选育的方法进行了简要的阐述,有助于科研工作者在该领域内积极地进行探索和交流。

通过大肠杆菌thyA染色体质-粒平衡致死系统构建无抗性基因表达载体

克隆了大肠杆菌和霍乱弧菌胸腺嘧啶合成酶基因thyA ,并以pcDNA3质粒为基础 ,分别用两种来源的thyA基因替代其氨苄抗性基因Amp,构建了不含抗性基因 ,且可在thyA营养缺陷型大肠杆菌中基于染色体 质粒平衡致死系统稳定传代的真核表达载体。该载体可有效表达红色荧光蛋白报告基因。

雄蚕新品种“秋丰×平28”的育成

以家蚕平衡致死系平30为受体亲本,以茧丝质优、抗性强的现行家蚕品种白玉为优良基因的供体材料,通过杂交、自交和回交3个过程,育成了经济性状优良的家蚕性连锁平衡致死系平28,用该品种与皮斑限性品种秋丰组配成雄蚕杂交组合秋丰×平28。杂交种的雄蚕率达98%以上,茧层率、万蚕茧层量、鲜茧出丝率分别比对照品种秋丰×白玉高3.1%、0.166 kg、1.76%,而且解舒率较为稳定,是一对综合经济性状优良的雄蚕品种。2005年通过浙江省家蚕品种审定。

家蚕性连锁平衡致死系的杂交改良方法

家蚕性连锁平衡致死系是专养雄蚕品种的关键亲本材料,为了全面改良其实用经济性状,初步建立了一种杂交改良家蚕性连锁平衡致死系的方法。该方法先将常规品种的雄性与平衡致死系的雌性连续回交,育成一个在性染色体W上带有易位的+l1基因的中间材料,然后再用此材料的雌性与平衡致死系雄性杂交,并连续自交,同时结合致死基因表型差异进行选择,育成新的平衡致死系品种。采用该方法改良育成的平衡致死系品种平60和普通品种华菁的一代杂交种,雄蚕率达99%以上,茧丝质量和生命力性状均达到了现行普通品种的雄蚕群体水平。

表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒沙门氏菌工程菌株的构建

目的采用平衡致死系统构建表达幽门螺杆菌尿素酶 B亚单位的减毒沙门氏菌工程菌株。方法 PCR扩增幽门螺杆菌尿素酶 B亚单位 ,与 p YA 3149(asd+ )载体质粒重组 ,转化减毒的伤寒沙门氏菌突变株 ,SDS- PAGE,用 western- blot分析其表达 ,并观察重组菌体外传代培养的稳定性。结果利用宿主 -载体平衡致死系统构建了表达幽门螺杆菌尿素酶 B亚单位的重组减毒沙门氏菌工程菌株 ,且在有选择压力的条件下在体外能稳定地繁殖、生长和传代。

春秋兼用雄蚕品种夏·华×平8的选育

以俄罗斯引进的性连锁平衡致死系S14和春用多丝量家蚕品种春日为材料 ,采用杂交、回交并结合测交和标记基因选择的方法 ,育成性连锁平衡致死系平 8,与常规蚕品种夏·华选配雄蚕杂交组合夏·华×平 8,其雄蚕率达到 99%以上。农村试养表现发育齐一、强健好养、产量高等特点。

家蚕性连锁平衡致死系原种的孵化率与发育调查

为了加速雄蚕品种的实用化进程,对家蚕性连锁平衡致死系原种平28、平30的雄性黄卵和雌性黑卵的孵化率、各龄期减蚕率等进行了调查。平28雄卵、雌卵及平30雄卵、雌卵的二日孵化率分别为39.67%、40.67%与29.50%、36.50%,黄色雄卵孵化率低于黑色雌卵,品种间的二日孵化率达极显著差异。平28雄卵、雌卵及平30雄卵、雌卵1-4龄的减蚕率分别为11.34%、17.62%与9.60%、13.24%,雌性减蚕率高于雄性,品种间的4龄起蚕率达显著性差异。对影响孵化及减蚕率的原因进行分析认为:黄色雄卵在蚕种保护过程中,卵内胚胎除受致死基因的影响外,也许更易受到外界环境诸如光线等的不利影响;平衡致死系的致死基因可能对正常孵化的蚕儿会产生微弱不利影响,从而影响正常孵出蚕儿的生长发育。

染色体-质粒平衡致死系统的构建及应用

以营养选择标志代替抗生素抗性标志为主要特征的染色体-质粒平衡致死系统的建立为基因工程产品的生产和基因治疗提供了更为安全,有效的操作平台。通过质粒载体基本元件与宿主菌之间的优化,构建出用于不同目的的外源基因的平衡致死系统。它对构建单价或多价减毒活菌苗起到了至关重要的作用;随着基因疫苗研究的深入,使它具有更为广阔的应用前景。本文着重讨论目前该系统的构建方法和应用。

鸡白痢沙门菌C79-13ΔcrpΔasd平衡致死系统的构建及其生物学特性的研究

目的:为了研制更加安全的鸡白痢沙门菌弱毒株,并将其开发为疫苗活载体。方法:本研究构建了鸡白痢沙门菌C79-13ΔcrpΔasd缺失株。双基因缺失株的构建是以含有重组自杀性质粒pREΔasd的大肠杆菌χ7213为供体菌,C79-13Δcrp为受体菌进行接合转移,两步法筛选crp/asd基因双缺失突变株。结果:PCR及测序结果表明C79-13ΔcrpΔasd构建成功。进一步研究表明,该缺失株的生长需要外源的二氨基庚二酸(DAP),且能稳定遗传缺失的asd基因,与亲本株C79-13相比,其血清型未发生变化,但其生长速度明显减慢,毒力明显降低。结论:C79-13ΔcrpΔasd双缺失株可接受asd+质粒作为宿主平衡致死系统高效稳定地表达外源基因,并为研制安全有效的鸡白痢沙门菌疫苗弱毒株以及进一步将其开发为适于黏膜免疫的口服活载体疫苗奠定了基础。

雄蚕品种选育及产业化应用20年的回顾与展望

雄蚕具有强健好养、饲料效率高、出丝率高、茧丝品质优等特点,选育雄蚕品种实现专养雄蚕是提高茧丝品质和综合效益最为有效的途径。本文综述了从俄罗斯科学院引进家蚕性连锁平衡致死系20年来,我国在家蚕性连锁平衡致死系转育改良方法研究、家蚕性别控制种质资源库构建、实用化雄蚕品种选育、雄蚕品种繁育配套技术开发及雄蚕品种产业化应用等方面取得的主要成果,分析了专养雄蚕产业化过程中存在的问题,提出了进一步加强雄蚕种、茧、丝绸及产品的一体化建设,打造雄蚕丝高端产品与品牌,提高全产业链综合效益的建议。

以减毒沙门菌为载体布鲁氏菌DNA疫苗的构建及免疫原性分析

目的构建携带布鲁氏菌BLS-L7/L12融合基因的重组减毒沙门菌并进行免疫原性分析,为口服布鲁氏菌DNA疫苗研究奠定基础。方法将BLS-7/L12融合基因克隆到真核表达载体asd+-pVAX1,依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd+-pVAX1-BLS-L7/L12)。以1×109CFU/只的剂量口服免疫Balb/C小鼠,3次免疫后进行免疫效果的评价。结果构建的重组减毒沙门菌质粒转染COS-7细胞经免疫组化和Western-blot试验证明BLS-L7/L12融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清和肠黏液中有特异性抗体IgG和sIgA产生。通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主。结论所构建的以重组沙门菌为载体口服布鲁氏菌DNA疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,且以细胞免疫应答为主。可作为潜在的布鲁氏菌新型疫苗。

夏秋用雄蚕品种限7×平48的育成

饲养雄蚕品种是提高蚕丝品质和蚕茧生产效益的重要途径之一。以引进的性连锁平衡致死系S-14为母本,用普通家蚕品种夏6为优良性状基因供体回交改良性连锁平衡致死系,经2轮杂交、自交、回交组成的循环改良和纯化,育成经济性状优良的家蚕性连锁平衡致死系平48,将该品种与家蚕限性皮斑品种限7组配成夏秋用雄蚕杂交组合限7×平48。经浙江省家蚕新品种实验室联合鉴定,该雄蚕品种的雄蚕率达99%以上,在农村生产鉴定试验中表现出强健好养、产量高、丝质优等特点:张种产茧量和50 kg桑产值分别较对照品种秋丰×白玉提高8.4%和9.4%;茧丝长、解舒丝长、解舒率和干茧出丝率分别较对照种提高7.9%、12%、2.57个百分点、1.54个百分点。新品种2009年通过浙江省家蚕新品种审定,适合在长江中下游蚕区的夏秋季饲养。

家蚕平衡致死系S-14的性连锁致死基因对生命力和全茧量的影响研究

利用从俄罗斯引进的性连锁平衡致死系S-14与普通家蚕品种的回交世代，初步查明：S－14平衡致死系的2个性连锁致死基因对家蚕生命力和全茧量2项性状无明显的不良作用。

春秋兼用雄蚕新品种蒙草×红平4的育成

采用回交法,利用常规家蚕品系红云回交改良家蚕性连锁平衡致死系材料平28,育成了新的日系家蚕性连锁平衡致死系红平4,并与限性皮斑中系品种蒙草组配成雄蚕杂交组合蒙草×红平4。经实验室和农村鉴定,蒙草×红平4的雄蚕率达98%以上,健康易养,茧丝质优,产量和产值稳定,是一个优良雄蚕品种,适宜云南春季和秋季饲养。

春秋兼用雄蚕新品种云蚕7×红平2的育成

雄蚕品种的培育和应用对于提高叶丝转化效率与生丝品位具有重要作用。以家蚕性连锁平衡致死系材料平30作为供体亲本,普通家蚕品种云蚕8作为受体亲本,采用回交改良的方法,育成了新的日系家蚕性连锁平衡致死系红平2,用该品系与限性皮斑中系品种云蚕7组配成雄蚕杂交组合云蚕7×红平2。经实验室鉴定和农村饲养鉴定,该雄蚕品种的雄蚕率达98%以上,且具有强健好养,产量稳定,茧丝产量高、品质优的特点,其中在四川、湖南、贵州、浙江4省实验室鉴定的虫蛹率、茧丝长、解舒丝长、解舒率、鲜茧出丝率分别比对照品种菁松×皓月提高0.63个百分点、155 m、154 m、1.9个百分点、1.5个百分点,茧丝洁净达到97.2分。该雄蚕品种适合在云南蚕区春秋期推广饲养,可生产缫制高品位生丝的原料茧。

多丝量雄蚕新品种华菁×平72的育成

以多丝量为主要选育目标,提高雄蚕品种的茧丝生产性能。以家蚕性连锁平衡致死系平8为受体,普通家蚕品种872为优良性状基因供体,采用回交改良家蚕性连锁平衡致死系的方法,育成了经济性状优良的新平衡致死系平72。将该平衡致死系与多丝量限性斑纹品种华菁组配成雄蚕杂交组合华菁×平72,一代杂交种的雄蚕率达100%。经浙江省家蚕新品种实验室鉴定,华菁×平72的万蚕产茧层量5.016 kg,洁净96.36分,鲜茧出丝率19.00%,分别比多丝量家蚕品种菁松×皓月高0.308 kg、1.70分、1.56个百分点,是一对综合经济性状优良的多丝量雄蚕新品种。