Construction of a trivalent candidate Shigella vaccine strain with host-vector balanced-lethal system

A trivalent live Shigella vaccine candidate FSD01 against S. flexneri 2a, S. sonnei and S. dysen-teriae I was constructed. This candidate strain was based on the S. flexneri 2a vaccine T32. By homologous recombi-nation exchange, the chromosomal asd gene of T32 was site-specifically inactivated, resulting in the strain unable to grow normally in LB broth, while another asd gene of S. mutans was employed to construct an Asd complementary vector. This combination of asd ’host/ Asd+ vector formed a balanced-lethal expression system in T32 strain. By use of this system, two important protective antigen genes coding for S. sonnei Form I antigen and Shiga toxin B subunit were cloned and expressed in T32, which led to the construction of trivalent candidate vaccine FSD01. Experimental results showed that this strain was genetically stable, but its recombinant plasmid was non-resistant. Moreover, it was able to effectively express trivalent antigens in one host and induce protective responses in mice against

回交改良家蚕性连锁平衡致死系的研究

将家蚕性连锁平衡致死系与优良常规品种杂交后 ,F1代自交 ,再与平衡致死系回交 ,然后利用标记基因选择 ,可以把常规品种的血缘导入平衡致死系 ,改良其经济性状。本文对这一方法进行了研究 。

雄蚕新品种“秋丰×平28”的育成

以家蚕平衡致死系平30为受体亲本,以茧丝质优、抗性强的现行家蚕品种白玉为优良基因的供体材料,通过杂交、自交和回交3个过程,育成了经济性状优良的家蚕性连锁平衡致死系平28,用该品种与皮斑限性品种秋丰组配成雄蚕杂交组合秋丰×平28。杂交种的雄蚕率达98%以上,茧层率、万蚕茧层量、鲜茧出丝率分别比对照品种秋丰×白玉高3.1%、0.166 kg、1.76%,而且解舒率较为稳定,是一对综合经济性状优良的雄蚕品种。2005年通过浙江省家蚕品种审定。

夏秋用雄蚕品种限7×平48的育成

饲养雄蚕品种是提高蚕丝品质和蚕茧生产效益的重要途径之一。以引进的性连锁平衡致死系S-14为母本,用普通家蚕品种夏6为优良性状基因供体回交改良性连锁平衡致死系,经2轮杂交、自交、回交组成的循环改良和纯化,育成经济性状优良的家蚕性连锁平衡致死系平48,将该品种与家蚕限性皮斑品种限7组配成夏秋用雄蚕杂交组合限7×平48。经浙江省家蚕新品种实验室联合鉴定,该雄蚕品种的雄蚕率达99%以上,在农村生产鉴定试验中表现出强健好养、产量高、丝质优等特点:张种产茧量和50 kg桑产值分别较对照品种秋丰×白玉提高8.4%和9.4%;茧丝长、解舒丝长、解舒率和干茧出丝率分别较对照种提高7.9%、12%、2.57个百分点、1.54个百分点。新品种2009年通过浙江省家蚕新品种审定,适合在长江中下游蚕区的夏秋季饲养。

多丝量雄蚕新品种华菁×平72的育成

以多丝量为主要选育目标,提高雄蚕品种的茧丝生产性能。以家蚕性连锁平衡致死系平8为受体,普通家蚕品种872为优良性状基因供体,采用回交改良家蚕性连锁平衡致死系的方法,育成了经济性状优良的新平衡致死系平72。将该平衡致死系与多丝量限性斑纹品种华菁组配成雄蚕杂交组合华菁×平72,一代杂交种的雄蚕率达100%。经浙江省家蚕新品种实验室鉴定,华菁×平72的万蚕产茧层量5.016 kg,洁净96.36分,鲜茧出丝率19.00%,分别比多丝量家蚕品种菁松×皓月高0.308 kg、1.70分、1.56个百分点,是一对综合经济性状优良的多丝量雄蚕新品种。

染色体-质粒平衡致死系统的构建及应用

以营养选择标志代替抗生素抗性标志为主要特征的染色体-质粒平衡致死系统的建立为基因工程产品的生产和基因治疗提供了更为安全,有效的操作平台。通过质粒载体基本元件与宿主菌之间的优化,构建出用于不同目的的外源基因的平衡致死系统。它对构建单价或多价减毒活菌苗起到了至关重要的作用;随着基因疫苗研究的深入,使它具有更为广阔的应用前景。本文着重讨论目前该系统的构建方法和应用。

春秋兼用雄蚕新品种蒙草×红平4的育成

采用回交法,利用常规家蚕品系红云回交改良家蚕性连锁平衡致死系材料平28,育成了新的日系家蚕性连锁平衡致死系红平4,并与限性皮斑中系品种蒙草组配成雄蚕杂交组合蒙草×红平4。经实验室和农村鉴定,蒙草×红平4的雄蚕率达98%以上,健康易养,茧丝质优,产量和产值稳定,是一个优良雄蚕品种,适宜云南春季和秋季饲养。

猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd缺失株平衡致死载体系统的构建及鉴定

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。为了研制更加安全并保持C500株良好免疫原性的弱毒株,及将C500开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体,本文构建了猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd双缺失株平衡致死载体系统。首先构建含缺失320bp的crp(cAMP受体蛋白)基因与蔗糖敏感基因(sacB)的重组自杀性质粒,与C500接合转移,两步法筛选无抗性的△crp缺失株,用PCR证实基因组crp基因的缺失突变。用同样方法在crp缺失株基础上构建asd(天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶)基因缺失株。该缺失株生长必需外源DAP(二氨基庚二酸)。进一步鉴定△crp缺失株的表型、生长特性、毒力等,结果表明△crp△asd缺失株构建成功。△crp△asd缺失株可以用来作为宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因,为深入研究以C500株为载体的口服多价疫苗奠定了基础。

基于AFLP的家蚕性连锁平衡致死系Z染色体连锁分子标记筛选

平48(以下简称P48)是通过转育方法将性连锁平衡致死系的群体性比控制基因转移到白云品系培育而成的。研究以P48与白云(BY)这对近等位基因系为分析材料,利用AFLP筛选并分析差显标记,经PAGE电泳、片段回收、克隆、测序及与家蚕(P50)基因组数据库序列比对发现家蚕性连锁平衡致死系Z染色体特异性连锁标记C094,该标记与P50的对应序列间存在明显差异。进一步设计差异引物对P48与P50及其杂交F1代进行PCR验证,确定C094标记与家蚕性连锁平衡致死系P48致死基因l1连锁,这为进一步鉴定及克隆致死相关基因奠定了基础。

春秋兼用四元雄蚕品种菁·云×平28·平30的育成

以提高雄蚕品种繁育系数为主要选育目标,从现有蚕品种资源中选配具有高产卵量性状的中系斑纹限性杂交原种与强健好养的日系平衡致死系杂交原种,通过四元雄蚕杂交组合的选配与比较筛选,得到繁育系数高、强健好养、茧丝质优的春秋兼用四元雄蚕杂交组合菁·云×平28·平30。经浙江省家蚕新品种农村生产鉴定与杂交种繁育试验,新品种的张种产茧量、张种产值、健蛹率分别为569 kg、2 701元与9702%,分别比对照品种秋·华×平30高43 kg、193元、313百分点;解舒丝长、干茧出丝率分别为7211 m、3401%,分别比对照品种长594 m、高194百分点。经蚕种场繁育试验,菁·云×平28·平30的杂交种克蚁制种量达154张,比对照品种增加21张,增幅达1579%,可有效降低雄蚕种生产成本。2019年4月四元雄蚕品种菁·云×平28·平30通过浙江省农作物新品种审定。

家蚕性连锁平衡致死系致死基因的SSR定位

家蚕性连锁平衡致死系(S-14)雄蚕的两条Z染色体分别携带有一个非等位、紧密连锁的隐性胚胎期致死基因l1(lethal gene1)和l2(lethal gene2)。两个致死基因的致死时期分别是转青期和G2期。将S-14品系的雄蚕和家蚕P50品系的野生型雌蚕杂交,F1代雄蚕和P50品系雌蚕回交,即P50×(P50×S14)。回交后代雌蛾根据父本(F1代雄蚕)携带l1或l2基因分成两类BC1-l1和BC1-l2,分别用来做l1和l2基因定位。利用公布的家蚕全基因组序列筛选l1基因和l2基因所在Z染色体与P50品系Z染色体间的差异SSR标记,分别获得16个和18个差异性SSR标记,用差异性标记检测BC1-l1和BC1-l2,最终将l1基因定位在Z染色体物理图谱中的19.79Mb位点到染色体末端约2.60Mb范围内,将l2基因定位在Z染色体物理图谱的17.86Mb位点到18.55Mb位点约0.69Mb范围内。

猪霍乱沙门氏菌C78-1株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死载体系统的构建及生物学特性研究

为开发减毒猪霍乱沙门氏菌的活疫苗载体,通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建了猪霍乱沙门氏菌C78-1株ΔcrpΔasd双基因缺失株,并对其生物学特性进行探讨。首先构建含有缺失1 488bp asd基因的重组自杀性质粒pREΔasd,然后与已构建完成的ΔcrpC78-1缺失株进行接合转移,采用两步法筛选无抗性的C78-1的ΔcrpΔasd双缺失株。PCR鉴定结果表明,C78-1的ΔcrpΔasd双缺失株构建成功;进一步研究表明,该缺失株的生长需要外源的二氨基庚二酸(DAP),且能稳定遗传缺失的asd基因,与C78-1相比,其血清型未发生变化,但其生长速度明显减慢。ΔcrpΔasd C78-1双缺失株可接受asd+质粒作为宿主平衡致死系统高效稳定地表达外源基因,为开发以C78-1为载体的口服多价疫苗奠定了基础。