改良萃取法制备脱细胞神经支架的去髓鞘效果评价

【目的】评价改良化学方法制备脱细胞神经支架的去髓鞘与脱细胞效果。【方法】12只成年SD大鼠(230～280g),取双侧坐骨神经,随机分为3组,每组8例,分别采用不同的处理方法。正常对照组:不作任何处理;Hudson组:采用Triton X-200、磺基三甲铵乙内酯-10(SB-10)、磺基三甲铵乙内酯-16(SB-16)处理;改良组:采用Triton X-200、SB-10、SB-16联合脱氧胆酸钠(SDC)及过氧乙酸(PAA)处理。处理后行HE染色、甲苯胺蓝染色及透射电镜检查,观察脱细胞、去髓鞘程度及基底膜保存情况。【结果】形态学检查显示,与对照组相比,Hudson组中的细胞核结构完全消失,甲苯胺蓝染色为散在同心圆状的髓鞘结构,透射电镜下显示髓鞘板层成分保留,但有崩解断裂,轴突依然存在;改良组细胞核完全去除,与Hudson组不同的是,甲苯胺蓝染色显示为不规则多孔状结构,髓鞘成分消失,透射电镜下显示髓鞘及轴突成分彻底去除,基底膜管壁结构清晰并完整保留。【结论】改良萃取法制备脱细胞神经支架能够有效地去除细胞和髓鞘成分,同时基底膜管结构保留完整。

人工神经桥接体修复神经缺损的研究

目的:观察冷冻处理后的兔胚胎施万细胞(Schwann cells,SCs)种植到去细胞基膜管中移植对周围神经缺损再生的影响,寻求修复周围神经缺损较为理想的方法。方法:取成年雄性兔88只,建立左侧上臂正中神经20 mm缺损模型,随机分为4组,每组22只,分A组:自体神经移植组,B组:去细胞基膜管桥接体组,C组:去细胞基膜管种植未冷冻处理胎兔SCs的桥接体组,D组:去细胞基膜管种植两步冷冻处理胎兔SCs的桥接体组,4组修复兔正中神经缺损。于16周内不同时间段行大体观察,光、电镜组织学观察及形态定量学分析(再生有髓神经纤维密度、髓鞘平均厚度、有髓纤维直径),检查各组桥接体运动神经传导速度,称指浅屈肌肌肉湿质量;术后8周行辣根过氧化物酶(horseradish peroxi-dase,HRP)逆行示踪标记,观察神经功能恢复。结果:C组和D组神经再生及功能指标(再生有髓神经纤维密度、髓鞘平均厚度、有髓纤维直径、运动神经传导速度、肌肉湿质量恢复率)与A组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。6周时C组存在单核细胞浸润情况较D组严重,胶原纤维形成稍多。8周行HRP逆行示踪标记,A、B、C、D 4组背根神经节和脊髓前角运动神经元均可见深蓝色或蓝黑色阳性细胞,B组阳性细胞数(5.00±2.16)个与其他3组比较差异有统计学意义(P<0.05),D组(12.5±3.87)个﹑C组(11.75±2.16)个与A组(13.50±4.20)个比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:采用两步冷冻法处理后的兔胚胎SCs种植到去细胞基膜管中制备人工神经桥接体,经培养后桥接修复兔正中神经缺损能提高神经再生质量,很少发生免疫排斥反应,为神经修复提供了一种新方法。

复合bFGF及肝素的外周神经桥接体在神经修复中的作用

目的:探讨bFGF和肝素与外周神经桥接体复合后在兔正中神经缺损修复中的作用。方法:成年雄性新西兰兔48只,建立左侧上臂正中神经30mm缺损。随机分为4组,分别用不同神经桥接体修复神经缺损,即A组为去细胞基膜管种植雪旺细胞并复合bFGF及肝素的桥接体、B组为去细胞基膜管种植雪旺细胞的桥接体、C组为去细胞基膜管复合bFGF及Hep桥接体、D组为自体神经作为对照。于术后1月、3月分别取材行HE及Masson’s三色染色,光镜观察神经再生、神经内胶原纤维形成及血管形成;3月检测各组桥接体运动神经传导速度,并行透射电镜检查,称量指浅屈肌肌肉湿重,观察神经功能恢复。结果:复合bFGF及肝素的桥接体组(A组、C组)神经再血管化及神经胶原形成与自体神经差异无统计学意义(P>0.05),与B组比差异有显著统计学意义(P<0.01)。A组神经再生数据(再生有髓神经纤维密度、平均髓鞘厚度、有髓纤维直径及运动神经传导速度、肌肉湿重恢复率)与自体神经移植(D组)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:bFGF及肝素用于组织工程神经桥接体修复神经缺损,能提高神经桥接体再血管化水平,减少胶原纤维形成,促进轴突生长有利于神经再生质量的提高。

大鼠坐骨神经去细胞基膜管的组织形态学研究

目的:观察采用化学萃取法和反复冻融法制备大鼠坐骨神经去细胞基膜管的组织形态学变化。方法:雌性Sprague-Dawley鼠坐骨神经16条随机分为化学萃取法(chemicalextractednerve,CEN)和冻融法(freeze-thawednerve,FTN)两组,每组18条。分别予Trinton-100化学萃取、-196℃～20℃反复冻融处理后,光镜、电镜观察其组织、形态学变化。结果:(1)CEN组基膜管管壁完整、贯通,无细胞结构,可见管状神经轮廓。(2)FTN组基膜管管壁破损、管腔堵塞,轴突、髓鞘、雪旺细胞及小血管变性、坏死,可见大量细胞碎片。结论:两种方法均能保持周围神经正常的三维空间结构,CEN制备的周围神经去细胞基膜管更具有组织形态学优势。

大鼠坐骨神经去细胞基膜管异体移植的比较研究

目的:探讨化学萃取法(CEN)、冻融法(FTN)制备的异种鼠坐骨神经去细胞基膜管移植术后8、13、23天神经再生轴突距离、Schwann细胞迁入、再血管化及炎症反应异同。方法:将36只雌性Wistar鼠随机配对,分为CEN组与FTN组,每组18只,分别桥接移植两种方法制备的SpragueDawley鼠坐骨神经去细胞基膜管。观察术后8、13、23天移植物物理性状及组织形态学变化。结果:术后8、13、23天,神经轴突再生距离、近和远端Schwann细胞数、再血管化及炎症反应差异有显著性(<0.05),CEN组优于FTN组。结论:化学萃取法制备的异种周围神经去细胞基膜管较冻融法能更快、更好地修复周围神经缺损,亦应有更大的临床实用价值。

坐骨神经横断伤后远侧段组织的形态学及相关因子表达变化

目的:通过制备GFP小鼠和B6小鼠坐骨神经横断伤模型,应用免疫组化技术以及RealTime-PCR技术观察和分析周围神经损伤后远侧段组织的形态学及相关因子表达变化。方法:制备GFP小鼠坐骨神经横断伤模型,应用免疫组化技术分别染色S100蛋白以显示施万细胞,染色NF蛋白以显示轴突;结合GFP小鼠的自发荧光以及Hoechst核染观察横断伤后不同时间点远侧段组织的形态学变化。制备B6小鼠坐骨神经横断伤模型,应用RealTime-PCR技术检测横断伤后远侧段组织中相关营养因子BDNF、NGF、CNTF及抗凋亡因子Bcl-2 mRNA的表达变化。结果:坐骨神经横断伤后,远侧段施万细胞S100蛋白的表达第7天时达到高峰,第14天时下降,形成狭长细胞索带;第21～28天时仅少数细胞S100蛋白阳性。远侧段NF免疫组化产物于横断伤后第7天时断裂呈碎片状,第28天时碎片亦基本消失不见。远侧段非特异核染数目随损伤时间延长而增加。同时,在远侧段整个溃变过程中,神经基膜管结构仍然可见。坐骨神经横断伤后,BDNF mRNA表达第1～3周内逐渐上调,其中第3周时达到高峰(P<0.01),第4周时下降到与正常值相比无统计学意义的水平。NGF mRNA表达第1周时达到高峰(P<0.01),第2周时比第1周有小幅下降,但仍然具有统计学意义(P<0.01),第二周以后下降到与正常值相似的水平。CNTF mRNA表达则在损伤后第1周时下降了35%,第2周时继续下降到正常水平的42.7%,其下降均具有统计学意义(P<0.01),第3周时有所回升,第4周时下降到低点。Bcl-2 mRNA表达在损伤后第1周时下降,第2、3周时上升,第3周时达到高峰,并且上升具有统计学意义(P<0.01)。结论:坐骨神经横断伤后4周,远侧段神经组织中神经基膜管结构仍然存在。神经营养因子BDNF、NGF、CNTF mRNA的表达时相不同,提示其表达调控机制不同。Bcl-2 mRNA表达变化与施万细胞凋亡相关。

去细胞异体神经基膜管桥接神经缺损的实验研究

目的 探索修复周围神经缺损的新的有效替代材料。方法 将异体的预变性神经和正常神经经溶血卵磷脂裂解液处理后 ,得到一种没有细胞及细胞碎片的、空的神经基膜管 ,将其用来修复大鼠 15mm坐骨神经缺损 ,通过一般观察、肌萎缩测量、电生理检测、连续切片组织学观察和计算机图像分析来评价神经再生。结果 化学抽提的预变性神经和正常神经桥接物组均获得了密集的神经再生和良好的神经功能恢复 ,其中前者效果更为优越。

碱性成纤维细胞生长因子对组织工程化外周神经的影响

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和肝素与乳兔许旺细胞、去细胞基膜管、构成的复合型组织工程化外周神经桥接体修复兔正中神经缺损的效果。 方法 新西兰兔 48只 ,建立左侧上臂正中神经 3 0mm缺损模型 ,随机分为 4组 ,分别用去细胞基膜管种植许旺细胞并复合bFGF及肝素 (Hep)的桥接体 (A组 )、去细胞基膜管种植许旺细胞的桥接体 (B组 )、去细胞基膜管复合bFGF及Hep桥接体 (C组 )、自体神经 (D组 )修复神经缺损 ,于术后 1、3个月分别进行大体观察 ,Masson三色染色光镜观察神经再生、神经内胶原纤维形成及血管形成 ,3个月检测各组桥接体运动神经传导速度 ,并行透射电镜检查 ,称量指浅屈肌肌肉湿重 ,观察神经功能恢复。 结果 去细胞基膜管种植许旺细胞并复合bFGF及Hep的桥接体组 (A组 )神经再生及功能指标 (再生有髓神经纤维密度、平均髓鞘厚度、有髓纤维直径、运动神经传导速度、肌肉湿重恢复率 )与自体神经移植 (D组 )比较 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。 结论 bFGF及肝素与许旺细胞、去细胞神经基膜管构成的复合型组织工程神经桥接体修复神经缺损能提高神经再生质量。

人脐带间充质干细胞复合去细胞神经基膜管修复火鼠坐骨神经缺损

目的探讨诱导后的脐带问充质干细胞作为组织工程种子细胞修复大鼠坐骨神经缺损的可行性一方法从正常足月新生儿脐带中分离培养问充质干细胞并诱导分化为神经样细胞，与去细胞神经基膜管共培养以构建组织工程神经：用30只健康成年雄性sD大鼠建立坐骨神经缺损（10mm）的动物模型并随机分成3组：A组为脐带间充质干细胞复合去细胞神经基膜管组，B组为单纯去细胞神经基膜管组．C组为自体神经桥接组，、术后10周通过神经电生理检测、组织学观察等评测效果。结果在局部观察和肌肉测量、神经电生理检测、组织学观察等方面，脐带问充质干细胞复合去细胞神经基膜管组（A组）神经再生及肢体功能情况良好，效果接近于自体神经桥接组（C组），明显优于单纯去细胞神经基膜管组（B组）。结论脐带问充质十细胞复合去细胞神经基膜管构建的组织工程神经可有效促进大鼠坐骨神经缺损（10tnm）的修复、

大鼠股神经分支基膜管差异的实验研究

[目的]比较大鼠股神经分支基膜管结构和成分差异,为组织工程神经引导周围神经损伤后的精确再生提供依据。[方法]选取健康8周龄雄性SD大鼠30只,随机分为2组,实验组取股神经及其分支进行化学去细胞处理;对照组取新鲜股神经及其分支;观察指标为超微结构、组织学、免疫组织化学、拉曼光谱特征。[结果](1)超微结构:对照组股神经肌支髓鞘厚度大于皮支(1.28±0.41)μm vs (0.81±0.32)μm,(P<0.05),对照组股神经肌支基底膜厚度大于股神经皮支(34.55±2.23) nm vs (31.86±3.47) nm,(P<0.05);扫描电镜显示实验组去细胞处理后的取向性结构管状结构,无可见细胞结构;对照组扫描电镜显示可见明显分束的神经纤维及细胞结构;(2)组织学及免疫荧光显示:对照组股神经肌支乙酰胆碱酯酶染色阳性部位所占比例较大,皮支染色阴性部位所占比例较大;实验组去细胞处理后HE神经纤维呈均一红染管状细胞外基质结构,无蓝色可见细胞核结构;实验组神经去细胞处理后DAPI和Laminin染色为红色层粘连蛋白背景,无亮蓝色细胞核结构;(3)拉曼光谱分析显示:实验组神经去细胞处理后股神经肌支和皮支波峰出现位置无差异,主要为脂类和蛋白质及微量核酸。[结论]大鼠股神经肌支主要含运动神经纤维,皮支主要含感觉神经纤维;肌支和皮支的基膜管在结构上存在差异,其拉曼光谱特征基本相似。