PCR方法检测慢性粒细胞白血病 bcr/abl mRNA

应用筑巢式递转录／聚合酶链反应方法对３２例慢性粒细胞白血病患者的ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ进行检测，发现３１例有融合ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ表达。其中１９例表达为ｂ３ａ２型，９例表达为ｂ２ａ２型，３例同时表达为ｂ３ａ２、ｂ２ａ２型。慢性粒细胞白血病临床分期与ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ表达类型有关，加速期和急变期，同时表达两种类型居多，即易发生选择性拼接，该法灵敏度高达１０－６水平。

吉西他滨对慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞G-CSFR及bcr/abl mRNA的影响

为了观察吉西他滨对慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)及bcr/ablmRNA的作用,收集CML慢性期、急变期患者的及骨髓象正常的非血液病患者骨髓液,分为吉西他滨组(加入吉西他滨,调整浓度为10μg/ml)和对照组,培养48小时后收集细胞。采用流式细胞术检测各组标本骨髓G-CSFR的表达率;采用RT-PCR技术检测各组标本bcr/abl mRNA的表达。结果表明:吉西他滨组CML慢性期、急变期患者及骨髓象正常者骨髓G-CSFR的表达率分别为(50.72±8.57)%、(36.32±4.25)%和(59.42±7.62)%。对照组CML慢性期、急变期患者及骨髓象正常者骨髓粒系G-CSFR的表达率分别为(45.42±6.52)%、(30.58±5.68)%和(58.56±5.54)%。两组CML患者骨髓G-CSFR的表达率分别与骨髓象正常组比较,差异有显著性(p<0.05),CML慢性期患者与急变期比较,差异有显著性(p<0.05)。吉西他滨组CML患者G-CSFR的表达率与未加药组相应组别比较,差异有显著性(p<0.05)。吉西他滨组CML慢性期、急变期患者bcr/abl mRNA表达水平比较,差异无显著性(p>0.05)。吉西他滨组与对照组、CML慢性期、急变期患者G-CSFR表达率与bcr/abl mRNA表达水平呈负相关(p<0.05)。结论:在体外培养下,吉西他滨可以提高CML慢性期、急变期患者骨髓G-CSFR的表达率,对bcr/abl mRNA表达的作用不明显,CML慢性期、急变期患者G-CSFR表达率与bcr/abl mRNA表达水平呈负相关。

清毒饮对K562细胞bcr/abl mRNA基因表达的影响

目的观察不同药物浓度清毒饮对人白血病细胞株K562细胞bcr/abl基因表达水平的影响,为临床应用清毒饮提供依据。方法制备不同药物浓度清毒饮(5、10、20 mg/mL)含药血清并处理K562细胞48 h,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR技术分析各组培养细胞bcr/abl mRNA表达的水平。结果清毒饮中、高2种浓度清毒饮含药血清与对照组比较,对人白血病K562细胞株bcr/abl融和基因表达水平具有显著影响,差异有统计学意义(P<0.05,0.01),且呈浓度依赖性。结论清毒饮具有抑制人白血病K562细胞株bcr/abl mRNA表达的作用,提示清毒饮具有从分子水平抗肿瘤细胞增殖的效应。

qPCR检测慢性粒细胞性白血病细胞中BCR-ABL mRNA的表达及其意义

目的探讨实时荧光定量PCR(qPCR)检测BCR-ABL mRNA对慢性粒细胞性白血病(CML)患者异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后体内微小残留病(MRD)的早期预测和监测价值。方法选取2013年1月至2016年1月在深圳市盐田区人民医院、深圳大学医学院及北京大学深圳医院门诊和血液科住院的CML患者67例作为观察组,同期深圳市盐田区人民医院体检健康人群50例为对照组,用qPCR检测CML患者异基因造血干细胞移植前后BCR-ABL mRNA水平。结果对照组健康人群BCR-ABL mRNA检测均为阴性。移植前加速期和急变期的CML患者BCR-ABL mRNA水平高于慢性期,差异有统计学意义(P<0.05);移植后,前36个月各时间点qPCR检测的BCR-ABL/ABL比值均较移植前明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);移植36个月后qPCR仍然能检测出BCR-ABL/ABL的表达水平。结论qPCR方法准确可靠,对于临床诊断CML和MRD的检测具有重要的临床应用价值。

RT-PCR检测慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞集落bcr/abl mRNA的表达

采用ＲＴＰＣＲ 技术对ＣＭＬ 患者骨髓细胞１４ ｄ 的细胞集落群和部分１４ ｄ 或２８ ｄ 的单个细胞集落ｂｃｒ／ａｂｌ ｍ ＲＮＡ 表达进行分析。结果显示：所检测的骨髓细胞集落ｂｃｒ／ａｂｌ 基因的表达均呈阳性，即为ＣＭＬ 集落，与细胞遗传学分析结果一致。该方法为研究ＣＭＬ 造血前体细胞基因表达及其诊断、治疗监测提供了灵敏、有效的分析手段；并可作为研究ＣＭＬ 发病、治疗及筛选抗ＣＭＬ 药物较为理想的方法。

In Situ-RT PCR定量检测16例慢性粒细胞白血病仇bcr/abl融合基因

目的 研究原位逆转录多聚酶链反应技术（Ｉｎ Ｓｉｔｕ－ＲＴ ＰＣＲ）在检测慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因中的应用价值及其意义。方法：用 Ｉｎ Ｓｉｔｕ－ＲＴ ＰＣＲ方法测定 ＣＭＬ病人ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因表达量。结果：在不破坏细胞完整性条件下细胞系Ｋ５６２和ＣＭＬ病人检测到ｂｃｒ／ａｂｌＲＮＡ的扩增产物，表现为细胞浆内出现蓝紫色颗粒，计算这种阳性细胞的百分率来相对定量地检测ＣＭＬ病人ｂｃｒ／ａｂｌ ｍＲＮＡ的表达水平，这种检测技术的敏感性达１０－４水平以上。结论：Ｉｎ Ｓｉｔｕ－ＲＴ ＰＣＲ可以相对定量地检测ＣＭＬ病人ｂｃｒ／ａｂｌ ｍＲＮＡ的表达，直观地评价α－干扰素（α－ＩＦＮ）、骨髓移植（ＢＭＴ）等治疗ＣＭＬ的疗效，本检测方法敏感性高，又可用做微小残留病（ＭＲＤ）的检测。

BCR/ABL融合基因少见型实时荧光PCR定量检测在慢性髓系白血病中的应用

目的:探讨实时荧光定量聚合酶链反应法(real-time PCR)检测BCR/ABL少见融合型别在BCR/ABL常见型别阴性慢性髓系白血病(CML)中的临床应用价值。方法:收集2012年7月至2015年12月期间FISH检测或染色体核型分析存在Ph染色体的CML病例2 490例,其中BCR/ABL P210,P190和P230定量检测均为阴性的病例12例,对该12例样本采用实时荧光PCR法定量检测b2a3(e13a3)、b3a3(e14a3)、e6a2、e8a2和e1a3等5种罕见BCR/ABL融合型别。结果:12例样本中e1a3、e8a2、b2a3、b3a3和e6a2型别阳性分别为1、2、5、4和0例,阳性率分别为8.33%、16.67%、41.67%、33.33%和0%;总阳性率为100%,以b2a3型和b3a3型为主。结论:实时荧光PCR法定量检测BCR/ABL少见融合型别,可用于临床疑似CML而BCR/ABL常见型别定量检测阴性病例的诊断及微小残留病变监测。

筑巢式PCR检测慢性粒细胞白血病bcr/ablm RNA

目的：观察慢性粒细胞性白血病（CML）患者bcr／ablmRNA的表达情况。方法：应用逆转录筑巢式聚合酶链反应（NestedPCR）检测了32例CML患者的bcr／ablmRNA。结果：30例检测到bcr／ablmRNA；其中19例检测到bcrexon3／ablexon2mRNA,7M表达bcrexon2／abl。exon2mRNA．4例同时表达这两种mRNA。结论：NestedPCR是检测CML患者bcr／ablmRNA有效而敏感的方法。

BCR-ABLm RNA在慢性粒细胞白血病患者分期及预后评估中的临床价值

目的:探讨BCR-ABL mRNA表达在慢性粒细胞白血病(CML)患者分期及预后评估中的临床价值。方法:回顾性分析2016年11月至2018年10月本院收治的60例CML患者的临床资料,对比不同分期、不同危险度(Sokal预后评分)及治疗后不同时间段CML患者BCR-ABL mRNA表达情况。结果:BCR-ABL mRNA表达水平随着病情进展(慢性期<加速期<急变期)和危险度增加(低危者<中危者<高危者)均逐渐升高,随着治疗时间延长逐渐下降,治疗6、9、12个月时患者BCR-ABL mRNA表达水平均低于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:BCR-ABL mRNA检测在判断CML患者分期,评估疾病预后和疗效中具有一定临床应用价值。

实时定量RT-PCR监测慢性粒细胞白血病患者造血干细胞移植后bcr-abl mRNA水平

目的评价实时定量 RT-PCR(Q-PCR)技术用于监测慢性粒细胞白血病(CML)患者异基因造血干细胞移植(HSCT)疗效的意义。方法采用基于 TaqMan 探针的 Q-PCR 技术检测112例CML 患者 HSCT 后不同时间共316份骨髓标本 bcr-abl mRNA 的表达。bcr-abl mRNA 水平以内参基因abl 进行归一化。采用荧光原位杂交法(FISH)评估 HSCT 后是否达细胞遗传学完全缓解(CCyR)。结果 Q-PCR 实验可重复敏感度为5个拷贝。abl 及 bcr-abl 基因C_T 值的批内差及批间差均<2.0%。HSCT 后1个月开始持续处于 CCyR 状态的101例患者,中位跟踪时间为12(6～60)个月的289份标本表现为 HSCT 后各时间段均有一定数量患者可检测出 bcr-abl mRNA,总体上随着 HSCT 时间延长,中位水平逐渐降低。HSCT 后1个月中位 bcr-abl 水平为0.035%(0～0.406%),较本室资料初治 CML 慢性期患者中位水平降低3个对数级,3个月时为0.006%(0～0.683%),6个月开始降至0%(0～0.225%),移植6个月后标本最高 bcr-abl 水平为0.068%。8例患者 HSCT 后未达 CCyR 或遗传学复发时 bcr-abl 水平为0.12%～13.45%,其中5例患者遗传学复发前的1份标本(复发前1～2个月) bcr-abl 水平为0.09%～3.42%。9例持续 CCyR 患者 bcr-abl 水平曾经>0.090%,但随后均下降至0。2例急变期患者 HSCT 后1.6和3个月内持续 CCyR,但分别于1个月和1.5个月后进展为血液学复发,bcr-abl 水平亦从0及0.140% 分别急剧增至46.900% 和75.900%。结论 Q-PCR 技术精确、可靠,对CML 患者 HSCT 后有必要定期系列监测 bcr-abl 水平,以及时了解病情变化。对急变期患者需要更密切的监测。

bcr—abl mRNA检测在慢性粒细胞白血病诊治中的意义

目的探讨bcr—abl mRNA在慢性粒细胞白血病（CML）诊断、治疗及微小残留病变监测中的意义。方法采用实时定量聚合酶链反应（real—time PCR）方法检测324例CML患者518份标本的bcr—abl mRNA表达情况。结果CML慢性期、加速期和急变期患者的bcr-abl mRNA定量结果逐渐增高，分别为12．6％、25．4％和57．2％（P〈0．05）。异基因造血干细胞移植后的bcr—abl mRNA定量结果随时间延长逐渐降低，一般在移植6个月后转阴，服用伊马替尼（商品名：格列卫）与异基因造血干细胞移植病程相似，但融合基因转阴所用时间较长。结论real—time PCR检测bcr—abl mRNA对于诊断、评价疗效、监测微小残留病变以及预测疾病进展具有重要的临床应用价值。

重组PCR构建bcr-abl mRNA竞争RT-PCR内标物

目的竞争ＰＣＲ可用于ｍＲＮＡ的定量测定，为了得到白血病中ｂｃｒ－ａｂｌｍＲＮＡ定量ＰＣＲ的竞争内标物。方法利用重组ＰＣＲ技术，实施对ｂ３ａ２型ｂｃｒ－ａｂｌｃＤＮＡ中一２７６ｂｐ片段的缺失法定点突变。结果经ＤＮＡ序列分析证实，重组后的ｃＤＮＡ片段与重组前相比，５′和３′端大部分序列相同，仅中间５５ｂｐ的部分序列缺失，同时引入１９ｂｐ外源ＤＮＡ片段，即净缺失３６ｂｐ，得到２４０ｂｐ的重组ＰＣＲ产物。较ｂ２ａ２型ｂｃｒ－ａｂｌｃＤＮＡ相应的２０１ｂｐ扩增片段长３９ｂｐ，使之适于作为ｂ３ａ２和ｂ２ａ２型两类ｂｃｒ－ａｂｌｍＲＮＡ定量ＰＣＲ的通用内标物。

干扰素治疗慢性粒细胞白血病微量残留病疗效分析

应用染色体技术和聚合酶链反应方法检测干扰素治疗慢性粒细胞白血病完全缓解后微量残留病28例的疗效。发现治疗后2例Ph'染色体阴转，长期应用干扰素组Ph'染色体阳性率下降，1例bcr／ab1mRNA转为阴性。而短期应用干扰素组无Ph'染色体变化，或bcr／ab1mRNA阴转。按目前我们应用干扰素的剂量、疗程，很难达到有效清除bcr／ab1mRNA阳性细胞的目的。

酪氨酸激酶抑制剂逆转K562／A02细胞多药耐药的研究

本研究旨在比较酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(Imatinib)、尼洛替尼(Nilotinib)对K562/A02细胞多药耐药的逆转作用。用RT-PCR法检测各组mdr-1mRNA、bcr-abl mRNA表达;用Western blot法检测各组P-gp、P210蛋白表达;用流式细胞术检测各组细胞内柔红霉素(DNR)的蓄积。结果表明:0.0625μmol/L伊马替尼、5nmol/L尼洛替尼对K562/A02细胞无明显细胞毒性,伊马替尼和尼洛替尼上述剂量单独作用48小时均下调mdr-1mRNA、bcr-abl mRNA、P-gp、P210蛋白的表达,且尼洛替尼较伊马替尼作用更强。荧光强度检测显示,K562/A02细胞经伊马替尼、尼洛替尼单独处理48小时后,其细胞内DNR浓度分别为K562细胞中的7.85%、12.02%。结论:酪氨酸激酶抑制剂具有很好的逆转细胞耐药作用,且尼洛替尼较伊马替尼逆转作用更强。

三氧化二砷对慢性粒细胞白血病细胞系的作用(英文)

本研究探讨三氧化二砷 (As2 O3)对两种慢性粒细胞白血病 (CML)细胞系有无作用及作用机制。实验选用了两种不同的CML细胞系KU81 2和MEG 0 1及两种其它白血病细胞系U937和PL2 1 ,加入不同浓度的As2 O3(0 .2 ,2和 1 0 μmol/L) ,在不同时间计数活细胞数 ,观察细胞形态 ,并以TUNEL法和DNA凝胶电泳检测细胞有无凋亡的发生 ;同时检测 0 .2 μmol/LAs2 O3作用时细胞表面CD34 ,CD1 3 ,CD33 ,CD1 9,CD1 1b ,CD1 4和CD7的变化 ,并通过RT PCR检测细胞bcr abl水平及caspase 3的变化。研究结果发现 ,不同浓度的As2 O3对 4种细胞系的作用不同 ,1 0 μmol/L时 4种细胞系均会发生细胞凋亡 ,2 μmol/L时则仅CML细胞系KU81 2和MEG 0 1会产生凋亡 ,0 .2μmol/L时 4种细胞系均不发生凋亡。在培养 2 4小时后 ,4种细胞系表面的CD34 ,CD1 3 ,CD33 ,CD1 9,CD1 1b ,CD1 4和CD7等均无明显改变。RT PCR检测bcr abl的水平发现在 2种CML细胞系中无明显改变 ,其caspase 3的活性较对照细胞均有所增加。结论 :As2 O3在较高浓度下可诱导 4种白血病细胞系产生凋亡 ,在 2 μmol/L仅可诱导CML来源的两种细胞系产生凋亡 ,CML细胞系对As2 O3较其它两种细胞系敏感 ,其作用机制与caspase

KLF4基因表达与JAK2 V617F点突变的关联性研究

目的检测骨髓增殖性疾病(MPDs)中JAK2 V617F点突变与锌指蛋白转录因子(KLF4 mRNA)表达,探讨JAK2 V617F点突变与KLF4 mRNA表达水平与BCR/ABL阴性的MPDs的关系。方法用等位基因特异性聚合酶链反应(AS-PCR)技术检测4组JAK2 V617F点突变,根据结果分为阴性、阳性。反转录特异性聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测4组KLF4 mRNA的表达水平。结果BCR/ABL阴性的MPDs的62例患者中JAK2 V617F基因突变慢性特发性骨髓纤维化(IMF)中有5例,阳性率55.56%(5/9),原发性血小板增多症(ET)中有15例,阳性率57.69%(15/26),真性红细胞增多症(PV)中有23例,阳性率88.46%(23/26),慢性嗜中性白血病1例。慢性粒细胞性白血病(CML)、急性白血病(AL)、对照组均没有阳性病例。KLF4mRNA在每例样本中均有表达。KLF4 mRNA表达水平在PV组显著高于其他3组(P<0.05)。结论BCR/ABL融合基因阴性的MPDs患者存在高频率JAK2 V617F点突变,KLF4 mRNA在PV患者中高表达。JAK2 V617F突变导致了KLF4基因表达的增高。JAK2 V617F突变阳性的ET患者,易出现并发症。AS-PCR是一种简单、有效检测JAK2 V617F突变方法。