白血病bcr/abl mRNA的荧光定量RTP-CR检测

①目的 探讨bcr/abl基因表达水平与白血病诊断、预后的关系及在微小残留病检测中的意义。②方法 荧光定量RT PCR法 (FQ RT PCR)测定 34例不同类型及处于不同疾病阶段的白血病病人bcr/abl基因的表达。③结果 对照组bcr/abl基因表达均为阴性。慢性粒细胞白血病 (CML)病人bcr/abl基因表达阳性率为 89.5 % (1 7/ 1 9) ,经治疗达临床缓解者 8例 ,bcr/abl基因表达均值为 (2 .4 3± 0 .6 7)× 1 0 5基因拷贝 /L ;初诊CML未经治疗及治疗无效并发生急变或死亡者bcr/abl基因表达均值为 (2 .6 0± 0 .90 )× 1 0 7基因拷贝 /L ,两者有极显著性差异(t=3.4 3,P <0 .0 1 )。随访 4例CML ,2例治疗缓解 ,bcr/abl转录减少 ,无阴转 ;持续增高 2例中 ,1例急变 ,1例死亡。急性淋巴细胞白血病 (ALL)病人bcr/abl表达阳性率为 1 1 .8% (2 / 1 5 ) ,均复发 ,1例死亡 ,bcr/abl基因转录复发前表达明显增高。④结论 FQ RT PCR实验方法灵敏、快速、特异性好、结果准确 ;bcr/abl基因表达水平的定量观察及动态监测 ,有助于白血病的临床诊断与分型 。

抗慢性粒细胞性白血病bcr/abl mRNA真核表达载体的构建

目的 构建一个含M1RNA、具有特异性抗慢性粒细胞性白血病 (CML)细胞融合基因bcr/ablmRNA的真核表达载体 ,以用于CML的分子靶向治疗。方法 以pTK117为模板 ,通过PCR方法合成一个带有导引序列 (GS)的M1RNA ,再将PCR产物克隆到真核表达载体pNAV 1上 ,得到重组质粒pAVGS4,转化大肠埃希菌JM 10 9,以碱裂解法小量抽提 ,酶切电泳鉴定 ,并测序鉴定。结果 以EcoRⅠ和SalⅠ酶切、1%的琼脂糖凝胶电泳显示在 5 0 0和 65 0 0bp附近各有一条明亮的条带。应用PCR方法测序的结果与模板序列一致。 结论 构建的 pNAV 1经酶切和测序鉴定 ,与目标序列一致 ,含有核酶、具有抗bcr/ablmRNA的真核表达载体构建成功 。

抗bcr/abl mRNA特异性核酶作用于靶基因的细胞内外切割实验

目的 将已构建的具有抗慢性粒细胞性白血病(CML)融合基因bcr/abl mRNA的含核酶载体,进行细胞内外实验,了解抗bcr/abl mRNA核酶的切割效应。方法 含有抗靶基因的真核表达载体pAVGS4经酶切后,其中抗CML核酶M1-GS RNA的DNA序列被构建到pUC19上得到pGS210,并经酶切和测序鉴定;合成bcr/abl融合位点前后的一段靶序列,克隆到pGEM-7zf(+)上得到p bcr-abl经测序鉴定,将pGS210和p bcr-abl进行体外转录,获得 M1-GS RNA及其作用底物,将两者混合、孵育,通过放射自显影术检测切割的效果;将pAVGS4转染到CML细胞株K652细胞内,通过RT-PCR方法了解核酶对于目标 RNA的作用效应。结果 p bcr-abl经酶切电泳及测序证实载体中含有目标序列,Ml-GS RNA作用于底物后,放射自显影术检测显示底物 RNA被有效切割。pAVGS4转染到K562细胞48和72h后,RT-PCR显示bcr/abl mRNA被有效切割。结论 pAVGS4可以有效地切割K562细胞内的bcr/abl mRNA,预期可作为CML分子靶向治疗的工具。

bcr/abl mRNA反义寡核苷酸对慢性粒细胞白血病Ph^+细胞的作用

Ph^+慢性粒细胞白血病(CML)的bcr/abl融合基因在其发病机制中具有重要作用。为研究bcr/abl反义寡核苷酸对CML细胞的作用,将合成两种18个碱基的bcr/abl硫代反义寡核苷酸与相应CML细胞系(K562细胞)及患者细胞共同孵育。结果发现,bcr/abl反义寡核苷酸可明显抑制K562细胞生长;对CML细胞CFU-GM抑制率为54％—91％,部分病例CFU-GM可有bcr/abl mRNA消失而PCR检测为阴性。上述抑制都是序列特异性的,与剂量呈正相关关系。通过流式细胞仪PI染色分析DNA含量,检测具有凋亡间接特征的亚二倍体细胞数量,发现反义寡核苷酸诱导细胞凋亡是其主要作用机制。本实验为bcr/abl反义寡核苷酸CML基因治疗及体外骨髓净化提供了依据。

吉西他滨对慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞G-CSFR及bcr/abl mRNA的影响

为了观察吉西他滨对慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)及bcr/ablmRNA的作用,收集CML慢性期、急变期患者的及骨髓象正常的非血液病患者骨髓液,分为吉西他滨组(加入吉西他滨,调整浓度为10μg/ml)和对照组,培养48小时后收集细胞。采用流式细胞术检测各组标本骨髓G-CSFR的表达率;采用RT-PCR技术检测各组标本bcr/abl mRNA的表达。结果表明:吉西他滨组CML慢性期、急变期患者及骨髓象正常者骨髓G-CSFR的表达率分别为(50.72±8.57)%、(36.32±4.25)%和(59.42±7.62)%。对照组CML慢性期、急变期患者及骨髓象正常者骨髓粒系G-CSFR的表达率分别为(45.42±6.52)%、(30.58±5.68)%和(58.56±5.54)%。两组CML患者骨髓G-CSFR的表达率分别与骨髓象正常组比较,差异有显著性(p<0.05),CML慢性期患者与急变期比较,差异有显著性(p<0.05)。吉西他滨组CML患者G-CSFR的表达率与未加药组相应组别比较,差异有显著性(p<0.05)。吉西他滨组CML慢性期、急变期患者bcr/abl mRNA表达水平比较,差异无显著性(p>0.05)。吉西他滨组与对照组、CML慢性期、急变期患者G-CSFR表达率与bcr/abl mRNA表达水平呈负相关(p<0.05)。结论:在体外培养下,吉西他滨可以提高CML慢性期、急变期患者骨髓G-CSFR的表达率,对bcr/abl mRNA表达的作用不明显,CML慢性期、急变期患者G-CSFR表达率与bcr/abl mRNA表达水平呈负相关。

清毒饮对K562细胞bcr/abl mRNA基因表达的影响

目的观察不同药物浓度清毒饮对人白血病细胞株K562细胞bcr/abl基因表达水平的影响,为临床应用清毒饮提供依据。方法制备不同药物浓度清毒饮(5、10、20 mg/mL)含药血清并处理K562细胞48 h,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR技术分析各组培养细胞bcr/abl mRNA表达的水平。结果清毒饮中、高2种浓度清毒饮含药血清与对照组比较,对人白血病K562细胞株bcr/abl融和基因表达水平具有显著影响,差异有统计学意义(P<0.05,0.01),且呈浓度依赖性。结论清毒饮具有抑制人白血病K562细胞株bcr/abl mRNA表达的作用,提示清毒饮具有从分子水平抗肿瘤细胞增殖的效应。

RT-PCR检测慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞集落bcr/abl mRNA的表达

采用ＲＴＰＣＲ 技术对ＣＭＬ 患者骨髓细胞１４ ｄ 的细胞集落群和部分１４ ｄ 或２８ ｄ 的单个细胞集落ｂｃｒ／ａｂｌ ｍ ＲＮＡ 表达进行分析。结果显示：所检测的骨髓细胞集落ｂｃｒ／ａｂｌ 基因的表达均呈阳性，即为ＣＭＬ 集落，与细胞遗传学分析结果一致。该方法为研究ＣＭＬ 造血前体细胞基因表达及其诊断、治疗监测提供了灵敏、有效的分析手段；并可作为研究ＣＭＬ 发病、治疗及筛选抗ＣＭＬ 药物较为理想的方法。

慢性髓细胞白血病伴BCR::ABL1 e6a2转录本1例并文献复习

慢性髓细胞白血病伴BCR::ABL1 e6a2转录本发病率低,临床较为罕见,本文报道1例慢性髓细胞白血病伴BCR::ABL1 e6a2转录本患者的诊治经过,并复习相关文献,探讨其流行病学特点、诊治和预后。

TKI治疗慢性粒细胞白血病患者BCR-ABL^(IS)减半时间对获得深层分子学反应的早期预测

目的:探讨酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗慢性粒细胞白血病(CML)患者BCR-ABL^(IS)减半时间(HT)对获得深层分子学反应(DMR)的早期预测价值。方法:回顾性分析本院2014年1月至2022年6月收治的一线予以伊马替尼治疗且具有完整病例资料的初诊CML患者的连续数据。结合患者临床特征及各时点疗效分析,应用Logistic回归模型探索患者获得DMR的独立影响因素联合HT与3个月BCR-ABLIs水平对DMR进行早期预测。结果:单因素与多因素分析结果显示,HT与3个月BCR-ABLIs水平为患者获得MR4、MR4.5、stable MR4.5的独立影响因素(P<0.05)。ROC曲线分析确定HT的最佳截断值为28 d,与HT>28 d的患者相比,HT≤28 d的患者分别在2年、3年和5年更容易获得DMR(74.2%vs 27.3%,71.2%vs 22.7%,63.6%vs 25.0%,均P<0.001)。按照3个月BCR-ABL^(IS)水平及HT将患者分为4组,Kaplan-Meier分析结果显示,BCR-ABL^(IS)≤10%且HT≤28 d组获得累计MR4及MR4.5的概率高于BCR-ABL^(IS)≤10%且HT>28 d组(P<0.05);BCR-ABL^(IS)>10%且HT≤28 d组获得累计MR4及MR4.5的概率高于BCR-ABL^(IS)>10%且HT>28 d组(P<0.05)。结论:除了早期分子学反应(EMR)之外,HT可作为CML疗效的另一重要预测指标,二者联合对于患者获得DMR具有更准确的早期预测价值。

新型BCR-ABL抑制剂的设计合成与构效关系

通过对现有的BCR-ABL变构抑制剂阿西米尼(asciminib)进行结构优化研究,得到N-苯基吲哚啉-5-甲酰胺分子骨架Ⅰ,并以该分子骨架为基础,利用分子对接辅助设计合成化合物1~12,使用ESI-MS和NMR对其进行结构表征,后续采用CCK-8法测定目标化合物在体外抗BCR-ABL1依赖型Luc-Ba/F3细胞增殖能力。最终筛选出高活性先导化合物1,针对该化合物在后续成药性评价中暴露出的清除率高、半衰期短等问题进行了其成药性质优化,引入亲水性基团,后续设计并合成化合物13~22,其中化合物17具有较好的细胞抑制活性,清除率较低,半衰期较长,有望作为临床候选化合物展开进一步的生物活性和成药性的评价。

CD13、CD33在BCR-ABL^(+)急性淋巴细胞白血病患者骨髓中的表达及其与临床特征和预后的相关性

目的:探讨髓系抗原CD13、CD33在BCR-ABL^(+)急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)患者骨髓中的表达及其与临床特征和预后的相关性。方法:应用实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative-polymerase chain reaction, RQ-PCR)检测119例初诊ALL患者骨髓BCR-ABL表达水平。用流式细胞学检查检测ALL的抗原表达水平。对照分析单纯BCR-ABL^(+)患者中CD13^(+)和CD13-以及CD33^(+)和CD33-患者在初次诱导缓解率(initial-induction remission rate, CR1)和总生存率(overall survival rate, OS)的区别。结果:在BCR-ABL^(+)的ALL患者中,初诊时CD13^(+)患者较CD13-患者具有较低的首次诱导缓解率,差异具统计学意义(P<0.05),但CD33^(+)患者较CD33-患者首次诱导缓解率无统计学差异。CD13^(+)组及CD33^(+)的OS显著低于CD13-组及CD33-组(P<0.05)。结论:BCR-ABL^(+)ALL患者中CD13^(+)及CD33^(+)提示预后不良。

新型数字PCR对慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因的检测效果研究

目的:针对慢性粒细胞白血病建立用于BCR-ABL融合基因检测的新型d PCR体系,探讨其在BCR-ABL^(p190/210/230)检测中的分析性能和临床适用性。方法:开发检测BCR-ABL^(p190/210/230)的新型d PCR体系,比较其与q PCR的灵敏度差异,及在慢性粒细胞白血病患者减药或停药期间药物副作用改善的差异。结果:在176份样本中,q PCR和d PCR在检测BCR-ABL的灵敏度方面表现出较高的一致性(82.39%),d PCR的阳性率约为q PCR的5倍(20.45%vs 3.98%)。随访期间,减药或停药的初始d PCR阴性患者较减药或停药前血常规(25%vs 10%)、肾/肝/胃(25%vs20%)及心脏功能(10%vs 0)均有明显改善。结论:d PCR检测体系可应用于BCR-ABL^(p190/210/230)检测,较q PCR一致性佳,阳性检出率高,基于d PCR指导的停药或减少剂量在改善药物副作用上有一定效果。

定量检测bcr-abl mRNA在慢性粒细胞白血病患者异基因造血干细胞移植后的意义

本研究确切了解CML患者异基因造血干细胞移植后bcr-abl mRNA的变化情况,为临床诊断早期复发提供实验依据。用实时荧光定量PCR方法检测15例慢性粒细胞白血病(CML)患者异基因造血干细胞移植前后78份外周血和骨髓标本的bcr-abl mRNA水平。结果表明,移植前患者的bcr-ablmRNA水平较高,中位数为29.303%;移植后1个月时检测bcr-abl mRNA水平较移植前大幅度降低,中位数为0;移植后1年内,连续多次检测bcr-abl mRNA水平,变化模式不一致,但6个月后的总体水平较6个月前明显降低,移植1年以上的受者绝大多数bcr-abl mRNA检测不到,或偶可检测到,但水平极低(0.007%、0.004%和0.021%),所检测受者的骨髓和外周血像均正常;同期骨髓与外周血bcr-abl水平无明显差异,且变化趋势一致。结论:CML患者移植后早期bcr-abl水平变化起伏较大,连续动态检测可明确其变化趋势,有助于判断移植效果、指导临床治疗,但6个月前检测到bcr-abl存在并不提示疾病复发;检测外周血bcr-abl或许更适于临床上对患者的随访。

多重实时定量PCR检测BCR—ABL mRNA方法的建立

目的建立一种快速、可靠的实时定量PCR（RQ-PCR）检测BCR-ABL mRNA的方法。方法应用LightCycler技术，设计在同一PCR反应管内可扩增b3a2、b2a2、ela2几种常见的BCR-ABL转录本和b3a3、b2a3等少见转录本，并对RQ-PCR主要要素进行优化，评价优化后RQ-PCR的敏感性、特异性和可靠性。结果建立的RQ-PCR方法可检出10^3健康人单个核细胞中的1个K562细胞，最低可检出100个拷贝BCR—ABL分子。BCR—ABL和ABL的循环域值（C1）值（拷贝数）批内变异系数分别为0．68％（12．93％）和0．59％（8．60％），批间变异系数分别为1．14％（18．89％）和1．01％（12．72％）。结论RQ-PCR可作为评价慢性粒细胞白血病（CML）疾病进展、预后判断和骨髓移植后微量残留白血病监测的灵敏、可靠的方法。

慢性髓系白血病Ph染色体分析与bcr/abl mRNA检测

目的为进一步明确慢性髓系白血病（ＣＭＬ）患者中Ｐｈ染色体阳性细胞与ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因表达之间的关系和比较细胞遗传学分析与聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法在ＣＭＬ应用中的优缺点。方法用热变性姬姆萨Ｒ显带（ＲＨＧ）技术和逆转录筑巢式聚合酶链反应（ＲＴｎｅｓｔＰＣＲ）对３３例ＣＭＬ患者的骨髓或外周血进行了分析，对其中１１例异基因骨髓移植（ＡｌｏＢＭＴ）或α干扰素（ＩＦＮα）＋小剂量羟基脲（ＨＵ）治疗患者进行了短期随访。结果３３例中２９例为Ｐｈ染色体（＋），３０例表达ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ。６例患者ＢＭＴ后１～１４个月，４例为Ｐｈ（－），２例为Ｐｈ（＋）；ＰＣＲ分析２例为（－），４例为（＋）。５例ＩＦＮα治疗患者，２例分别在治疗后６和１２个月Ｐｈ（＋）细胞百分率比治疗前有所降低。４１份样品中，２种方法结果一致者３４份（８２．９％）。结论２种方法各有其优缺点，在ＣＭＬ患者的诊断和治疗监测中，最好是将细胞遗传学分析与ＰＣＲ方法相结合，以便为临床提供更为真实有用的信息。

实时定量RT-PCR监测慢性粒细胞白血病患者伊马替尼治疗过程中bcr/abl mRNA水平

目的观察甲磺酸伊马替尼(简称伊马替尼)治疗Ph+慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓bcr/ablmRNA水平的变化。方法采用实时定量(Realtimequantitative)RTPCR(RQPCR)技术连续监测34例α干扰素治疗无效Ph+CML患者在伊马替尼治疗前后不同时间120份骨髓标本bcr/ablmRNA水平。治疗前骨髓Ph+细胞百分率均≥95%。结果RQPCR的敏感度为10pgRNA,标准品日间差及日内差均<5%。10例伊马替尼治疗前标本中位bcr/ablmRNA水平为5.79%,各例之间差异甚大(0.24%～60.90%)。72份Ph+细胞百分率为0%～94%的治疗后标本bcr/ablmRNA水平与Ph+细胞百分率显著相关(r=0.82,P<0.001)。7例治疗12个月内达到完全遗传学缓解(CCyR)的患者bcr/ablmRNA水平随治疗时间延长而迅速降低,可供分析的6例患者治疗3个月时较治疗前下降65.9%～98.8%。达到CCyR后,bcr/ablmRNA水平随治疗时间延长继续下降,直至为0。4例治疗12个月后获得显著遗传学缓解患者(Ph+细胞百分率均<35%)bcr/ablmRNA水平缓慢下降,可供分析的3例患者治疗3个月时的bcr/ablmRNA水平分别比治疗前下降2.5%、18.5%及61.6%。5例持续遗传学无效,并且维持在慢性期的患者bcr/ablmRNA水平1例缓慢下降,2例缓慢上升,2例基本不变。4例治疗中发生急变的患者bcr/ablmRNA水平均逐步升高。

PMA特异性抑制K562细胞BCR/ABL和Fyn mRNA的表达

目的:研究12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波酯(PMA)对K562细胞BCR/ABL与Fyn mRNA表达的影响及两者之间的关系。方法:1～250μg/L PMA刺激K562细胞24 h后,应用实时荧光定量PCR技术检测各组BCR/ABL和Fyn mRNA的水平。结果:PMA明显抑制BCR/ABL和Fyn mRNA的水平,该下调作用均具有显著的量效关系,且BCR/ABL和Fyn的mRNA表达水平下调表现出明显的相关性。比较刺激Molt-4细胞株的结果,PMA抑制作用具有细胞选择性。K562细胞株经诱导后出现伪足样的形态改变。结论:PMA通过抑制BCR/ABL融合基因的转录下调Fyn转录水平。

PCR方法检测慢性粒细胞白血病 bcr/abl mRNA

应用筑巢式递转录／聚合酶链反应方法对３２例慢性粒细胞白血病患者的ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ进行检测，发现３１例有融合ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ表达。其中１９例表达为ｂ３ａ２型，９例表达为ｂ２ａ２型，３例同时表达为ｂ３ａ２、ｂ２ａ２型。慢性粒细胞白血病临床分期与ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ表达类型有关，加速期和急变期，同时表达两种类型居多，即易发生选择性拼接，该法灵敏度高达１０－６水平。