异硫氰酸苄酯通过激活p53和AMPK-FOXO1a信号通路诱导宫颈癌细胞周期阻滞和凋亡

目的 研究异硫氰酸苄酯(benzyl isothiocyanate, BITC)对小鼠U14宫颈癌细胞增殖的影响,基于转录组数据分析探讨细胞毒性机制。方法 MTT法检测BITC对U14细胞活性的影响,Hochest 33258和荧光倒置显微镜检测细胞核形态变化,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,基于Illumina Novaseq 6000测序平台建立BITC(20μmol·L^(-1))给药前后U14细胞转录组数据库,使用生物信息学分析手段对差异基因功能和信号通路进行富集分析。qRT-PCR和Western blot验证信号通路关键分子表达变化。结果 BITC呈时间和浓度依赖性抑制U14细胞的活性,阻滞细胞在G_(0)/G_(1)期,诱导了细胞凋亡,上调了Bax、CytC、cleaved caspase-9/3、下调了Bcl-2、cleaved caspase-7的表达量;通过转录组分析,差异基因主要富集在细胞周期、FOXO、p53、细胞凋亡等信号通路,qRT-PCR或Western blot验证p53、p21、Ire1a、Atf4、CHOP、AMPK、FOXO1a等分子表达上调,Cyclin D3,Cyclin E,Cdk2分子表达下调。结论 BITC阻滞U14细胞周期、通过caspase-3线粒体依赖途径和内质网应激途径诱导细胞凋亡,其机制与p53和AMPK-FOXO1a信号通路有密切关系。

异硫氰酸苄酯对荧光假单胞菌的抑菌活性及在牛肉保鲜中的应用

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)广泛存在于牛肉、鱼类、家禽和乳制品等生鲜产品中,成为引发食源性疾病的重要原因。以荧光假单胞菌ATCC 13525作为供试菌株,研究异硫氰酸苄酯(benzyl isothiocyanate,BITC)对菌株的抑制作用及其应用于牛肉的保鲜效果。结果表明:通过牛津杯实验法,得到BITC对荧光假单胞菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为0.25 mmol/L;表型实验表明BITC能够破坏细菌细胞膜的通透性并降低代谢活力;此外,相比于对照组,MIC处理组牛肉贮藏7 d内菌落总数、色差值、pH值、总挥发性盐基氮含量及氮氧化合物含量分别降低35.73%、21.52%、4.53%、54.39%和4.78%,而感官评分提高10.45%,说明BITC可以显著抑制荧光假单胞菌的生长,改善牛肉的感官品质及理化指标。因此,BITC在冷鲜牛肉贮藏保鲜方面具有较好的应用前景。

木犀草素稳定的不同油相Pickering乳液稳态化差异性研究

该实验以木犀草素(luteolin,LUT)为乳化剂、分别以碳链长度和不饱和双键数量不同的的玉米油(corn oil,CO)、亚麻籽油(linseed oil,LO)、南极磷虾油(Antarctic krill oil,AKO)为油相,构筑包埋异硫氰酸苄酯(benzyl isothiocyanate,BITC)的Pickering乳液,通过对乳液流变特性、光稳定性、贮藏稳定性、微观结构、氧化稳定性和BITC保留率的考察,明确碳链长度和不饱和双键含量不同的油相对LUT稳定的Pickering乳液特性的影响。研究结果表明,LUT稳定的Pickering乳液不会因油相中碳链长度和不饱和双键含量不同而影响其光稳定性;与LUT-CO和LUT-LO Pickering乳液相比,LUT-AKO Pickering乳液的表观黏度最大、空间结构更为均匀,贮藏14 d后平均粒径最小[(213.47±2.30)nm]、电位绝对值最大[(42.73±1.96)mV]、BITC包埋率最高[(65.25±1.45)%],但因AKO反应活性较强导致其Pickering乳液氧化稳定性略低;通过对LUT稳定的不同油相Pickering乳液稳态化差异性研究,明确碳链较长的AKO更适合作为制备稳定的Pickering乳液的油相,该研究为拓宽LUT稳定不同油相Pickering乳液的应用提供理论指导。

玛咖黑芥子酶的酶学性质及加工稳定性

新鲜玛咖块茎中的黑芥子酶经提取、透析、凝胶过滤层析纯化后,对其酶学性质、酶动力学参数以及干燥加工前、后玛咖中的黑芥子酶酶活力及其酶解产物异硫氰酸苄酯(BITC)的变化进行研究。凝胶渗透色谱测得纯化后的玛咖黑芥子酶的分子质量为190.9 ku。酶学性质研究结果显示:该酶的最适温度40℃,最适pH 7.0,金属离子Fe^(3+)、Cu^(2+)、Al^(3+)、Mg^(2+)、Zn^(2+)、Ba^(2+)对其有显著的抑制作用。采用Lineweaver-Burk法测得玛咖黑芥子酶的动力学参数Vmax=0.2383(μmol/L)/min,Km=0.1425 mmol/L。玛咖鲜果中的黑芥子酶酶活力为0.7256 U/g,BITC含量为3.3190 mg/g。将玛咖鲜果样品切片后分别在温度为50,60,70,80℃下干燥处理,结果显示:随着干燥温度的上升,玛咖干片样品中的黑芥子酶酶活力显著下降,BITC含量呈下降趋势。本研究完善了玛咖黑芥子酶的理论研究,并提出采用60℃以上温度对玛咖进行干燥处理可有效抑制黑芥子酶酶活力,为玛咖的加工利用提供了参考。

番木瓜种子中异硫氰酸苄酯(BITC)的抑癌试验

利用MTT法检测番木瓜种子中的异硫氰酸苄酯(BITC)在体外对肝癌细胞等6种常见癌细胞的生长抑制率。结果表明,番木瓜种子提取物中BITC的浓度达到5μmol.L-1(相当于0.745mg.L-1)时,对人肝癌HepG2细胞、人肺癌A549细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人大肠癌HCT-8细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人前列腺癌DU-145细胞的生长抑制率均达到70%以上,其中,人肝癌细胞HepG2最敏感,cBITC=2.5μmol.L-1时抑制率可达87%,在cBITC=10μmol.L-1和5.0μmol.L-1时,人大肠癌HCT-8细胞的生长抑制率几乎相同。因此,BITC具有良好的抑癌效果。

番木瓜籽挥发油纳米结构脂质载体的制备及抗假丝酵母菌活性研究

番木瓜(Carica papaya Linn.)属十字花目番木瓜科,广泛分布于热带、亚热带地区。课题组前期研究发现,番木瓜籽挥发油的主成分为异硫氰酸苄酯(BITC),含量高达99%,具有天然、无污染、纯度高等特点,且对多种假丝酵母菌均具有明显的抑制作用。但由于BITC水溶性差、易挥发、易降解等缺点,限制了其应用。本研究采用熔融乳化超声法制备异硫氰酸苄酯纳米结构脂质载体(BITC-NLC),并进行形态、粒径及Zeta电位、包封率、载药量等方面的表征及其抗假丝酵母菌活性研究,旨在提高BITC的稳定性和抑菌效果。在单因素试验基础上通过正交试验设计,优化纳米结构脂质载体(NLC)的制备工艺和BITC-NLC的处方组成,得到最佳制备工艺:初乳搅拌20 min,超声分散15 min(振幅80%);最佳处方组成:单硬脂酸甘油酯50 mg,辛癸酸三甘油酯50 mg,聚醚F188400 mg,大豆卵磷脂400 mg,BITC100 mg,蒸馏水20 mL。采用透射电子显微镜观察形态,纳米粒度及Zeta电位测定仪测定粒径及Zeta电位,高效液相色谱法测定包封率和载药量。最终制备得到的BITC-NLC呈类球形,平均粒径为79.13 nm,Zeta电位为–21.77 mV,包封率为91.52%。初步稳定性试验结果显示,BITC-NLC在25℃下贮存30 d的稳定性良好。采用微量稀释法测得制剂对供试白假丝酵母菌(Candida albicans)和热带假丝酵母菌(C.tropicalis)的最低抑菌浓度(MIC)为8~32μg/mL,比原料药BITC的抑菌效果好,且对耐药菌株也具有抑菌效果。综上,本研究制备的番木瓜籽挥发油新剂型BITC-NLC粒径小,稳定性好,包封率高,对假丝酵母菌抑制作用强,为大量存在且多被丢弃的番木瓜籽的合理开发和综合应用提供依据。

新疆产玛咖的挥发油成分研究

目的:检测新疆玛咖(Maca,Lepidium meyenii Walp.)挥发油成分及探讨提取过程中挥发油主成分的变化规律。方法:采用水蒸气蒸馏法和气质联用技术对新疆引种玛咖中的挥发油成分进行分析,并研究提取时间、缓冲液浓度对玛咖挥发油主成分的影响。结果:分离鉴定了新疆玛咖挥发油成分32种,用外标面积归一化法测得其总挥发油含量为1.72%,其中异硫氰酸苄酯、苯乙腈为其主要成分。通过对提取过程中挥发油成分的转化分析,发现提取时间和缓冲液浓度对所得的挥发油主成分有显著影响。结论:气质联用技术可用于引种玛咖的快速鉴别及品质分析,而提取过程中要对提取时间和盐浓度严格控制。

番木瓜种子提取物异硫氰酸苄酯对肝癌细胞凋亡的影响

目的:通过异硫氰酸苄酯(benzyl-isothiocyanate,BITC)对体外培养的人肝癌细胞株HLE和Bel7402的凋亡影响,初步探讨BITC调控肝癌细胞凋亡的可能机制.方法:3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)染色法检测不同浓度BITC对肝癌细胞增殖的影响;选择具有抑制肝癌细胞生长的BITC浓度处理肝癌细胞后4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染色法进行凋亡的形态学观察;Caspase3酶活性检测试剂盒检测细胞中的Caspase3酶活性;Western blot法检测具代表性的凋亡相关蛋白Caspase8和Caspase3,细胞周期相关蛋白Cyclin D1的表达.结果:MTT结果显示BITC对人肝癌细胞的增殖有明显的抑制作用,用浓度为40μmol/L的BITC处理时,HLE和Bel 7402细胞存活率分别为71.56%和78.09%,和对照组比较,有统计学差异(P<0.05);当用浓度为80μmol/L的BITC处理时,HLE和Bel 7402生长率分别为32.91%和53.06%,和对照组比较,有统计学显著性差异(P<0.01);经BITC处理后的细胞,DAPI染色显示细胞特征性凋亡变化;Western blot和Caspase活性检测结果显示,随着BITC浓度增加,Caspase8和Caspase3蛋白表达水平及活性呈上升趋势,而细胞周期蛋白Cyclin D1的表达则明显下降.结论:BITC对人肝癌细胞增殖有抑制作用,并能诱导肝癌细胞凋亡;BITC通过激活Caspase8和Caspase3信号途径以及抑制细胞周期进展诱导细胞凋亡.

辣根素类化合物的合成及抑菌活性研究

本文选用1,3-二溴丙烷、邻苯二甲酰亚胺钾、硫脲、二硫化碳及取代溴苄为原料,经5步反应合成8个未见文献报道的辣根素类化合物,通过核磁氢谱、碳谱及质谱对其结构进行了表征。选取大肠杆菌(DH5a)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、白色葡萄球菌(ATCC8799)、藤黄八叠球菌(ACCC11001)、枯草芽孢杆菌(ATCC6633)、蜡状芽孢杆菌(ACCC11077)及四联球菌(ATCC35098)测试室内杀菌活性,实验结果表明合成化合物具有良好的杀菌活性,其中6a对藤黄八叠球菌的最小杀灭浓度仅为4μg·m L-1。

异硫氰酸苄酯对产气荚膜梭菌抑菌作用的研究

研究了异硫氰酸苄酯(BITC)对产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的抑菌作用。结果表明:BITC对供试菌的最小抑菌浓度(MIC值)为400μL/L;在不同pH(4～8)条件下,随pH的降低,MIC值变小,抑菌作用增强;在不同糖、盐浓度(1%～5%)条件下,随糖、盐浓度的升高,MIC值变小,抑菌作用增强;在透射电镜下观察发现,BITC破坏了菌体的荚膜和细胞壁。

异硫氰酸苄酯的防癌抗癌作用与生物合成研究进展

异硫氰酸酯类(ITCs)是十字花科植物重要的次生代谢产物,具有防癌抗癌作用。极具营养价值的热带水果番木瓜中也含有此类成分——异硫氰酸苄酯(B ITC),且含量较高。本文对BITC在防癌抗癌方面的活性及其作用机制、植物体内的生物合成途径及植物分布方面的国内外研究进展予以综述,为进一步研究开发BITC提供理论依据。

番木瓜籽中硫代葡萄糖苷的超声辅助降解研究

超声波辅助番木瓜籽中硫代葡萄糖苷的降解试验中,在内源酶水解硫代葡萄糖苷的基础上进行超声波辅助。在单因素基础上,对超声时间、超声功率、超声温度3个因素进行优化。以异硫氰酸苄酯得率最高为优化目标,发现超声时间、超声功率、超声温度之间具有一定的交互效应。得到的最优超声时间16.17 min、超声功率60 W、超声温度38℃,异硫氰酸苄酯的得率为0.558%,此时硫代葡萄糖苷的酶解率为63.62%。

异硫氰酸苄酯及其类似物抑菌活性的初步探究

本文对异硫氰酸苄酯及其类似物(异氰酸苄酯、异硫氰酸苯酯、异硫氰酸苯乙酯、异硫氰酸乙酯)对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑菌活性进行初步探究。通过对抑菌圈、最低抑菌浓度、最低杀菌浓度、生长曲线、能量代谢及构效关系研究,初步探究了异硫氰酸苄酯及其类似物的抑菌基团及抑菌机理。结果表明:5种物质对两种受试菌种均具有抑菌作用,尤其对金黄色葡萄球菌最为敏感;其抑菌活性是由异硫氰酸基团、亚甲基以及苯环三者共同作用的结果,并且异硫氰酸基团对其抑菌活性的决定性作用最大、亚甲基次之、苯环最弱。结构不同物质对细菌的代谢活性及相关酶活性的影响也不同。其中,异硫氰酸基团对能量代谢影响最大,氧原子被硫原子取代后进一步增强了这种作用,苯环的存在对能量代谢的影响产生反向作用。但对能量代谢影响最为明显的抑菌物质,其抑菌活性并不是最强的,这说明可能还存在其他抑菌机理。

从辣木籽中制备4-α-L-鼠李糖基-异硫氰酸苄酯的工艺优化研究

【目的】探索从辣木籽中酶解提取4-α-L-鼠李糖基-异硫氰酸苄酯(4-[(α-L-rhamnosyloxy) benzyl] isothiocyanate,GMG-ITC)的工艺条件及纯化方法。【方法】通过单因素和正交试验的方法,优化了对脱油辣木籽中硫代葡萄糖苷进行酶解提取,进而以二氯甲烷为溶剂进行萃取及重结晶可获得高纯度的GMG-ITC。【结果】通过高效液相色谱法测定酶解提取液中GMG-ITC含量,筛选出制备辣木籽GMG-ITC的最佳酶解提取工艺为:时间9 h,料液比1∶60 (g∶mL),pH值为5.0,温度30℃。【结论】建立了简化且高效的辣木籽脱油、酶解提取、萃取、重结晶4步新工艺组合,制备得到产率为4.70%、纯度达98%的GMG-ITC。

扩展青霉基因组DNA五种提取方法比较

为寻找一种适合于扩展青霉基因组DNA的提取方法,比较了固体培养、液体静置培养和液体振荡培养3种培养方式的提取效果,分别采用氯化苄法、蜗牛酶法、CTAB法、SDS法及异硫氰酸胍法提取扩展青霉菌基因组DNA,经DNA质量浓度测定及电泳分析,比较5种方法的差异,并利用扩展青霉的多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase)基因内一段保守序列,设计PCR引物,扩增大小为288bp的特异目的基因,检测其灵敏性。结果表明:固体培养的方式较适合扩展青霉基因组DNA的提取,另外5种提取方法均能提取出扩展青霉菌基因组DNA,扩增出目的条带,其中氯化苄法和蜗牛酶法所提DNA的纯度均较好,但蜗牛酶法所提DNA量较少。因此,氯化苄法是5种提取方法中最可靠的DNA提取方法,所提DNA浓度高、纯度好、结果稳定,可作为PCR反应的模板进行特异性扩增,且该方法的最低检测限大约为1.01×10-1μg/mL。

异硫氰酸苄酯作用下大豆胞囊线虫的运动及孵化

为研究异硫氰酸苄酯(benzyl isothiocyanate,简称BITC)对大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode,SCN,Heterodera glycines)的影响,对BITC和3种背景溶剂(乙醇、甲醇和二甲基亚砜)处理下大豆胞囊线虫二龄幼虫(J2)的活动和卵的孵化率进行测定。结果表明,3种溶剂对SCN卵的孵化及J2的行为影响差异显著。J2对3%和5%的乙醇、甲醇以及2%、4%的二甲基亚砜(DMSO)敏感。3%、5%的乙醇处理1h后,J2视觉评估分析(VAA)值与对照相比下降明显;3%、5%的甲醇处理1h后,J2的活动显著被抑制,但1%的甲醇和清水对照处理没有显著差异。2%和4%的DMSO处理后线虫活性与对照相比显著降低。以1%甲醇为溶剂,0.02和0.03mmol/L BITC能迅速降低J2的活性,0.03 mmol/L BITC处理2h和0.02mmol/L处理4h,J2完全失去活动能力;0.03mmol/L BITC处理6d的卵孵化率显著降低(P<0.05);不同浓度BITC处理完整胞囊后48h,孵化率与对照仍无显著差异。结果表明,大豆胞囊线虫J2对不同溶剂的敏感性差异明显,以1%甲醇为溶剂,0.02和0.03mmol/L BITC可显著降低J2活动能力,自由卵和胞囊卵比J2更抗BITC。试验结果可为杀线虫药剂筛选时溶剂的选择提供重要的信息,为深入研究BITC的作用机理提供理论依据。

异硫氰酸苄酯对脑胶质瘤U-87 MG细胞周期的影响及其机制

目的观察异硫氰酸苄酯(BITC)对人脑胶质瘤细胞系U-87 MG细胞周期的阻滞作用,并探讨其机制。方法取对数期U-87 MG细胞分别以2、5μmol/L的BITC处理,应用流式细胞仪检测细胞周期分布,Western blotting法检测细胞周期相关蛋白Cyclin B1、Cdc2、p21、Cdc25C及磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达,RT-PCR法检测Cyclin B1、Cdc2、p21和Cdc25C的mRNA表达,报告基因技术检测NF-κB、缺氧诱导因子(HIF)和真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)的转录活性。结果 BITC作用24 h后,U-87 MG细胞周期G2/M期比例显著升高,Cyclin B1、Cdc2、Cdc25C、p-Akt蛋白表达下调,p21蛋白表达上升,Cyclin B1、Cdc2、Cdc25C、p21 mRNA表达均显著下降,NF-κB、HIF、eIF4E转录活性均显著下降(P均<0.05)。结论 BITC对U-87 MG细胞周期有阻滞作用,机制可能与抑制Akt/NF-κB信号转导路径,进而调节细胞周期相关基因表达有关;此为胶质瘤的细胞周期靶点治疗提供了新思路。

番木瓜中异硫氰酸苄酯及其前体物质苄基硫代葡萄糖苷的含量分析

目的:建立番木瓜中抗癌活性物质异硫氰酸苄酯及其前体物质苄基硫代葡萄糖苷的含量测定方法,并测定它们在番木瓜各部位中的含量。方法:苄基硫代葡萄糖苷采用HPLC法,以依利特Hypersil BDS-C18(200 mm×4.6 mm,5μm)为分析柱,用含0.1%三氟乙酸的乙腈-水梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1,检测波长214 nm。异硫氰酸苄酯采用GC法,色谱柱为SPB1701石英毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25μm),程序升温,载气为氮气。FID检测器温度280℃,进样口温度250℃。结果:苄基硫代葡萄糖苷在0.91～36.4μg范围内线性关系良好(r=0.9992),异硫氰酸苄酯在0.0174～0.556μg范围内线性关系良好(r=0.9992)。除成熟果肉外,苄基硫代葡萄糖苷在其他部位均能检测到,且以种子中含量最高为4.74 mg·g-1;而异硫氰酸苄酯只在花和种子中检测到,以种子中含量较高为0.605 mg·g-1。结论:所建方法可用于番木瓜中苄基硫代葡萄糖苷和异硫氰酸苄酯的含量测定。

番木瓜籽中异硫氰酸苄酯抗癌抑菌功能研究进展

番木瓜(Carica Papaya)是一种极具营养价值而被广泛种植的热带水果,其籽中含有苄基硫代葡萄糖苷(Glucosinolate,GS),约占番木瓜重量7%,是果肉加工的废弃物。GS主要存在于细胞空泡,当其接触到芥子酶就会被水解,生成异硫氰酸酯类(Isothiocyanates,ITCs)。ITCs是十字花科植物的次生代谢产物,是一类重要的有机合成中间体,公认具有防癌抗癌功效以及抑菌作用,异硫氰酸苄酯(Benzyl isothiocyanate,BITC)是ITCs中生物学效果最为明显的一种。BITC对许多癌症有明显的抑制作用,可以阻断癌细胞增殖分化;BITC对致病菌有抑制甚至杀死作用,这种抑菌活性可以作用于细菌和霉菌。本文结合国内外相关研究现状,综述BITC在防癌抗癌及抑菌方面的研究进展,为番木瓜籽副产物BITC更深一步的加工以及番木瓜综合利用率的提升提供一定的理论依据。

异硫氰酸苄酯羟丙基-β-环糊精包埋物理化特性研究

以羟丙基-β-环糊精为壁材,对异硫氰酸苄酯进行了包埋,以增加异硫氰酸苄酯的溶解度和提高热稳定性。研究了包埋物的相溶解曲线,并通过红外光谱、热重分析、扫描电镜观察,对包埋物进行特性研究。相溶解曲线显示羟丙基-β-环糊精对异硫氰酸苄酯的增溶效果显著,相溶解曲线属于AL型,羟丙基-β-环糊精和异硫氰酸苄酯按1:1的比例形成包埋物,包埋常数为408.8 L/mol;红外图谱显示包埋物中异硫氰酸苄酯的特征吸收峰减弱,说明异硫氰酸苄酯的-N=C=S基团进入羟丙基-β-环糊精空腔中;热重分析显示包埋后异硫氰酸苄酯的热稳定得到了一定程度的提高;通过扫描电镜观察可以看出,包埋物为不规则的结晶体。通过对异硫氰酸苄酯的包埋,一方面增加了异硫氰酸苄酯的溶解度,扩大了异硫氰酸苄酯的应用范围,另一方面也提高了其热稳定性,减少了异硫氰酸苄酯在加工过程中的热损失。