一株多粘类芽孢杆菌的鉴定及对水稻稻瘟病菌的抑菌作用

本研究旨在开发高效的微生物生防制剂,用于防治水稻稻瘟病。本研究从水稻根际土壤筛选到一株具有较好拮抗作用的菌株KH-19,通过形态学观察、生理生化试验和16S rDNA测序对该菌株进行鉴定,用牛津杯法和平板对峙法测定其抑菌活性,针对水稻稻瘟病进行了盆栽防效试验。结果显示:KH-19菌株为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa,该菌对3株供试菌株大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853和白菜软腐病菌BC2均有抑菌作用,对其他6种病原细菌和8种病原真菌也有较好拮抗作用,对水稻稻瘟病菌抑菌率达63.67%。盆栽试验结果显示随着KH-19菌液浓度的提高水稻稻瘟病病情指数随之降低,当菌悬液浓度为106~107 cfu/mL时,对接种第20天的稻瘟病防病指数达78.11%。P.polymyxa KH-19作为具有广谱抑菌活性的生防菌株,在防治水稻稻瘟病方面具有潜在应用价值。

小菜蛾幼虫生防菌株毒力测定及产毒条件优化

为丰富小菜蛾(Plutella xylostella)生物防治的微生物资源,本研究选用粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)、淡紫拟青霉(Purpureocillium lilacinum)和02号生赤壳属(Bionectria sp.)三种具有较好生防效果的菌株开展其对小菜蛾幼虫毒力的菌株筛选试验,同时对选出的高毒力菌株进行毒力测定和产毒条件优化。结果表明,三种菌株对小菜蛾幼虫都具有防治效果,其中以粉红粘帚霉的生防毒力最强。毒力测定显示,粉红粘帚霉的半致死时间(LT_(50))为30.88 h,半致死浓度(LC_(50))为4.365×10^(4)个孢子/mL。从产毒条件优化结果看出,粉红粘帚霉产毒的最适培养基为萨氏葡萄糖琼脂酵母膏(SDAY),最适pH值为6,最适培养时间为7 d。综上表明,粉红粘帚霉对小菜蛾幼虫具有毒力高、致病速度快等特点,具有较大的生防潜力,可作为防治小菜蛾的优良生防真菌。

花椒流胶病拮抗菌的分离鉴定及其生防机制

由三线镰刀菌(Fusarium tricinctum)引起的花椒流胶病是近年来危害严重的花椒病害之一。为获得F.tricinctum的优良拮抗菌株,采用平板对峙法,筛选分离得到一株具较强拮抗作用的花椒内生真菌HJ-18,其对F.tricinctum的抑制率达58.85%。基于形态学和ITS分子鉴定,初步确定HJ-18为裂褶菌(Schizophyllum commune,GenBank登录号为OP502072);经抑菌谱与稳定性测试发现,HJ-18对4种供试植物病原真菌均具抑制效果,培养滤液经不同光照、温度和pH处理后,抗真菌效果稳定,但对紫外线敏感;当菌株HJ-18培养滤液体积分数为50%时,对F.tricinctum菌丝生长抑制率为66.40%;扫描电镜结果显示,经菌株HJ-18培养滤液处理后,F.tricinctum菌丝出现褶皱,且表面有碎屑产生;盆栽试验表明,菌株HJ-18对花椒流胶病的相对防效为52.65%,与22.5%啶氧菌酯100倍液处理具有相同防效。以上结果表明,菌株HJ-18是一株具有生防潜力的内生真菌,可作为生防菌剂进行开发利用。

杨树烂皮病生防菌株X4筛选与鉴定

采用稀释法从杨树根际土壤分离到若干细菌,通过平板对峙法筛选出对杨树烂皮病病原污黑腐皮壳菌(Valsa sordida Nit)的拮抗菌株X4,其抑菌率达83.96%。菌株形态学、生理生化特征以及16S rDNA基因序列分析的鉴定结果表明:生防菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。生防菌株X4还对松球壳孢(Sphaeropsis sapinea)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、交链格孢(Alternaria alternata)、希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum)、杨灰星叶点霉(Phyllosticta populea)等病原菌有抑制作用,抑菌谱比较广。贝莱斯芽孢杆菌X4具有一定的林木病害防治应用潜力,可为研发杨树烂皮病生物防治提供新途径。

云南白菜根肿病拮抗菌的筛选及鉴定

【目的】获得对云南白菜根肿病具有高效拮抗作用的微生物菌株,为云南白菜根肿病的生物防治提供潜在的菌种资源。【方法】从云南省曲靖市麒麟区三宝乡大棚白菜根肿病发病严重的地块,采集正常生长或发病较轻的白菜植株及其根际土壤,分离筛选抑菌效果较好的菌株,并对其进行形态特征鉴定、生理生化检测及分子序列分析。【结果】经初步筛选共获得46株细菌。土壤样品中共分离出30株细菌,其中抑制效果最好的是TB⁃7菌株,该菌株对白菜根肿病菌休眠孢子萌发抑制率为76.88%;白菜植株内共分离出16株内生细菌,其中抑制效果最好的是EB⁃15菌株,该菌株对白菜根肿病菌休眠孢子萌发抑制率为67.38%。通过对比分析选择抑菌效果最好的TB⁃7菌株作为目标菌株,经鉴定,TB⁃7菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌,菌体菌落较小,颜色淡黄色,表面光滑且扁平,菌体湿润,不透明,边缘规则;生理生化指标检测结果显示,TB⁃7菌株是好氧菌,V⁃P、淀粉水解、pH 5.7,生长3项检测指标均呈阳性,柠檬酸盐、丙酸盐、D⁃木糖、L⁃阿拉伯糖、D⁃甘露醇、明胶液化、7%NaCl生长、硝酸盐还原8项检测指标均呈阴性;16S rDNA扩增产物约为1500 bp,测序结果表明,TB⁃7菌株与坚强芽孢杆菌(Cytobacillus firmus)同源性达到100%,鉴定该菌株为芽孢杆菌属的坚强芽孢杆菌。【结论】通过初步筛选及鉴定,获得1株对白菜根肿病菌休眠孢子抑制率达到76.88%的拮抗菌株,该菌株的获得可为解决云南本地日益严重的白菜根肿病的生物防治奠定基础。

酥梨采后灰霉病生防菌株的鉴定及抑菌作用

以微生物拮抗病原菌是防治病害安全高效的可行手段。通过对果实表面微生物进行筛选鉴定,以期得到一株可以有效抑制灰霉病的生物防治菌株。对拮抗菌株H-1进行形态学特征、生理生化特性分析,结合16S r DNA序列分析和gyrB基因序列分析构建系统发育树;采用平板对峙法结合果实伤口试验考察拮抗菌H-1在体外及梨果表面的抑菌作用。结果表明:经鉴定H-I菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis);B.velezensis H-1在体外条件下可显著抑制灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)、细极链格孢(Alternaria tenuissima)和串珠镰孢菌(Fusarium verticillioides)的菌丝生长,其中对灰葡萄孢霉菌丝的抑制作用最强;果实伤口试验表明,1×1011CFU/mL的B.velezensis H-1可完全抑制梨果表面灰霉菌生长。由此可见,B.velezensis H-1可以有效抑制梨果采后灰霉病的发生。

番茄灰霉病生物防治菌株的筛选

从土壤中筛选出对番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.)有较强拮抗作用的生物防治菌株94株,其中拮抗细菌22株,分离率为17.6%;拮抗放线菌53株,分离率为11.7%;拮抗木霉菌19株,分离率为28.8%。研究发现,拮抗细菌可产生抗生素类物质,且在121℃高温下处理30min不失活,放线菌的抗生物质大多不耐热。拮抗木霉菌具较强的营养竞争及重寄生作用,温室接种试验表明对番茄叶部灰霉病的防治效果达67.18%。

两株生防菌对烟草黑胫病的抑制活性及其鉴定

为测定烟草黑胫病生防菌K9-3和L14-2两菌株的生防潜力,通过对峙培养法、孢子萌发试验和盆栽试验测定对烟草黑胫病病原菌的抑制能力,以双层滤纸法和盆栽检测法测定在烟草根际定殖能力,并根据形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析,鉴定K9-3和L14-2两株生防菌。结果表明:在室内试验中,这两株生防菌可抑制烟草黑胫病病原菌菌丝的生长、游动孢子囊的形成、游动孢子的释放和休止孢子的萌发;在盆栽试验中,有效防治烟草黑胫病,L14-2对烟草黑胫病的防治效果达到96.29%,K9-3的防治效果为77.78%。同时,K9-3和L14-2均具有良好的根际定殖能力,以双层滤纸法测定其在烟草根部的定殖密度分别为1.30×105cfu.cm-1和7.00×104cfu.cm-1,在盆栽试验中两菌株在烟草根际土壤和烟草根部保持一定的定殖密度,在烟草根际土壤中的定殖密度随着时间经过有所下降,但在烟草根部定殖密度均稳定保持在105cfu.g-1以上。另外,两菌株的鉴定结果,K9-3鉴定为普城沙雷菌,L14-2鉴定为绿针假单胞菌。

黄瓜苗根围拮抗细菌X3的分子鉴定

采用生理生化、Biolog和16SrDNA分子鉴定3种不同方法,对抑制黄瓜苗期猝倒病病原真菌的细菌菌株X3进行了鉴定。生理生化鉴定显示该菌株为Pseudomonas aeruginosa;而Biolog鉴定显示其为P.spinosa;进一步对该菌株作16S rDNA基因的测定与分析,表明其与已报道的P.aeruginosa 16S rDNA具有93.7％的同源性,二者在所建系统发育树中处于同一分枝,据此确定该菌株为P.aeruginosa。

祁连山北坡青海云杉中龄林生物量随海拔的变化

【目的】研究祁连山区重要的水源涵养林———青海云杉林的生物量随海拔（2700～3300 m）的变化规律，为预测祁连山区的产水能力和实施黑河流域植被－水的综合管理提供科学依据。【方法】在祁连山中段北坡的排露沟小流域，沿海拔梯度，选取生长状况良好、具有代表性的林分布设样地，进行植被调查。在2700～2800，2800～2900，2900～3100和3100～3300 m 4个海拔区段共设置15块20 m ×20 m 样地。利用已有的青海云杉生物量估算方程，计算研究区森林生物量的平均值、各海拔区段内的森林生物量以及不同径级树木对总生物量的贡献量，据此分析森林生物量的大小及其随海拔变化规律的主要影响因素。【结果】研究区青海云杉林的生物量为（128.61±50.25） t·hm －2，中树（12.5 cm ＜DBH≤22.5 cm ）和大树（ DBH＞22.5 cm）是森林生物量的主要来源，二者所占比例分别为44%和35%，小树（5 cm ＜DBH≤12.5 cm）的生物量较少，仅占21%。随海拔升高，青海云杉林生物量呈“单峰”变化，在海拔2700～2800 m为（135.43±21.25）t·hm －2，在海拔2800～2900 m达到最大为（152.33±73.01）t·hm －2，在海拔2900～3100 m为（124.28±39.54） t·hm －2，在海拔3100～3300 m最小为（100.48±65.69） t·hm －2。不同海拔区段内，森林生物量的主要来源不同，在海拔2700～2800 m，以中树生物量最多，为63.54 t·hm －2（占该海拔区段内森林生物量的48%）；在海拔2800～2900 m，中树生物量继续增加，达到90.53 t·hm －2（占该海拔区段内森林生物量的59%），在海拔2900～3100 m，大树成为森林生物量的主要来源，其生物量为54.46 t·hm －2（占该海拔区段内森林生物量的45%）；在海拔3100～3300 m，大树生物量继续增加，达到71.46 t·hm －2（占该海拔区段内森林生物量的71%）。与附近地区相比，研究区青海云杉林的生物量（128.61 t·hm －2）与祁连山哈溪林场（132.90 t·hm －2）、祁连山平均值（169.80 t·hm －2）和全国平均值（156.66 t·hm －2）相近，但比甘肃省肃南县（282.54 t·hm －2）、祁连山寺大隆林区（217.41 t·hm －2）和祁连山北坡山区的平均值（209.24 t·hm －2）小。【结论】林分密度、温度和降水共同决定了森林生物量的大小及其海拔变化规律，海拔2800～2900 m是本研究区青海云杉林生长的最适宜场所。

放线菌混合菌剂对西瓜枯萎病的防治作用研究

本研究开展生防放线菌对尖镰孢西瓜专化型的皿内防效初筛,在此基础上进行多菌复配,变单一菌剂为放线菌混合菌剂使用,以期提高生防菌剂对西瓜枯萎病的防效。采用皿内抑菌试验、单一菌株的盆栽促生及定殖试验等筛选出对尖镰孢西瓜专化型防效较好的生防菌;制成混合菌剂并探究其对西瓜枯萎病的防治效果和对西瓜幼苗的促生效果。单一菌株S C 1 1、1 5 3、S F 6及其混合菌剂对西瓜枯萎病均有防治效果,其防效分别为2 5.8 7%、2 0.6 1%、1 6.7 2%和4 7.5 0%,且对西瓜幼苗有较好的促生效果,对植株鲜重的提升幅度分别达9 9.2 6%、1 2 4.4 4%、1 4 4.4 4%和1 6 2.2 2%,无论是防病方面还是促生方面,均以组合S C 1 1+1 5 3+S F 6效果最为理想。生防放线菌混合菌剂的防病促生作用明显优于单个菌株,混合菌剂各菌株间通过协同作用达到优势互补,充分发挥生防效果。

猕猴桃细菌性溃疡病生防菌的筛选、鉴定及其防效初探

从健康猕猴桃植株中筛选具有生防潜力的内生放线菌,为猕猴桃细菌性溃疡病防治提供材料。采用平板渗透法筛选对猕猴桃细菌性溃疡病具有拮抗作用的内生放线菌,通过测定不同拮抗内生放线菌发酵液对猕猴桃溃疡病病原菌(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae,Psa)的最低抑制浓度(Minimal Inhibitory Concentrations,MIC)筛选高抗性菌株;采用喷雾法及注干法进行高抗性菌株的田间防治试验;结合形态、生理生化特征及16S r DNA序列分析,明确高抗性菌株分类地位。从431株内生放线菌中筛选出7株具有明显抗性的菌株,其中菌株M109的抑菌效果最强(MIC值为0.91 mg/m L)。田间试验表明,菌株M109的喷雾法防效为72.1%,注干法防效为84.6%。分类鉴定结果显示菌株M109为肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)。试验表明,肉桂地链霉菌S.cinnamonensis M109对猕猴桃细菌性溃疡病防效显著,具有应用潜力。

西瓜枯萎病生防菌XG-1的筛选、鉴定及其抑菌作用

从湖北省荆州西瓜植株内分离出内生菌97株,通过平板对峙和抑菌圈法筛选出对西瓜枯萎病菌(Fusari-um oxysporum f.sp.niveum)具有较强拮抗作用的菌株XG-1。该菌株对棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb)、棉花立枯病菌(Rhizoctonia solani Kühn)等5种病原真菌均具有抑制作用。通过形态特征观察及16S rDNA序列分析将菌株XG-1鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。菌株XG-1能使西瓜枯萎病菌菌丝产生明显的畸形,对其孢子的萌发具有较强的抑制作用。

枯草芽孢杆菌生防菌株SEM-9根际定植及对根际土壤微生物多样性的影响

【目的】研究枯草芽孢杆菌生防菌株SEM-9在作物根际的定植规律及对根际土壤微生物多样性的影响。【方法】通过自然转化法对SEM-9菌株进行绿色荧光蛋白标记,利用倒置荧光显微镜观察该菌株在作物根际土壤、根表面及根系内组织的定植情况;并以土传病害土壤为试验对象,通过高通量测序初步分析SEM-9菌株处理后根际土壤中微生物多样性的变化。【结果】构建了稳定表达绿色荧光蛋白的重组菌株SEM-9-pGFP_(22)。荧光显微镜观察结果表明,SEM-9-pGFP_(22)重组菌株可以在根际土壤和根表面定植,但是无法在根内组织或细胞内定植。SEM-9菌液处理显著降低了黄瓜土传病害的发病率,提高了根际土壤真菌微生物的多样性。【结论】成功建立了SEM-9菌株的GFP标记方法,明确了该菌株的根际定植规律及对黄瓜土传病害的防治效果,为后期开发替代型微生物肥料奠定了基础。

2种生防菌株对杨树溃疡病原葡萄座腔菌的抑制作用

【目的】从生防菌株产生的拮抗作用酶及生防菌株对病原菌生长的影响2方面研究黄绿木霉(YGF9)和木贼镰刀菌(LX6F2)对杨树溃疡病病菌葡萄座腔菌的抑菌机制,为杨树溃疡病的生物防治提供参考。【方法】通过生防菌株在几丁质培养基、纤维素培养基、β-l,3-葡聚糖培养基和酪蛋白培养基上的反应和生长情况,判定生防菌株能否产生几丁质酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶;通过显微镜观察2种生防菌株对病原菌菌丝生长和孢子萌发的影响。【结果】菌株YGF9和LX6F2代谢过程中均能使β-1,3-葡聚糖培养基中的蓝色消失,说明2种菌株具有产β-1,3-葡聚糖酶的能力;2种菌株可以在酪蛋白培养基上形成水解圈,说明2种菌株具有产蛋白酶的能力;2种菌株在几丁质培养基和纤维素培养基上没有产生水解圈和透明圈,说明2种菌株可能没有产几丁质酶和纤维素酶的能力。菌株LX6F2的菌丝可以与病原菌菌丝平行生长、缠绕或穿插生长在病菌菌丝上,从而使得病原菌菌丝扭曲、变形、异常膨大;菌株YGF9的菌丝使得病原菌菌丝发生折叠、畸形、断裂,从而阻碍病原菌菌丝的生长;2种菌株的发酵产物均可导致杨树溃疡病菌葡萄座腔菌的孢子皱缩畸形、孢子内部结构发生变化,从而使病原菌孢子不能正常萌发;抑菌物质使病原菌芽管变短、扭曲畸形,从而芽管上长出的菌丝不能向前伸展,使孢子失去侵袭能力;生防菌株对孢子萌发的抑制率可达94%以上。【结论】2种生防菌株可通过自身产生的拮抗作用酶和影响病原菌菌丝生长和孢子萌发来达到对葡萄座腔菌的抑制作用。本试验中未发现2种生防菌株产生几丁质酶和纤维素酶,在后续研究中需用不同的试验方法进行验证。此外,本文仅对生防菌株产生拮抗作用酶进行了定性研究,没有计算其产酶量,若今后需要分离提取这些拮抗作用酶,则需要进一步对生防菌株的产酶量进行定量分析。

生防菌哈茨木霉Trichoderma harzianum T4对西瓜根围土壤细菌群落的影响

采用平板培养、末端限制性片段长度多态性(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)以及变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)的方法相结合探讨生防菌哈茨木霉Trichoderma harzianum T4对大棚西瓜根围土壤细菌群落及氨氧化细菌群落的影响,为其在田间应用的生态安全性的评估提供支撑。末端限制性片段长度多态性以及变性梯度凝胶电泳的结果均表明哈茨木霉T4施入田间约四周内对根围土壤细菌群落产生明显的影响,随后这种扰动现象逐渐减小。对DGGE中受影响条带的测序结果表明,生防菌T4促进了假单胞菌Pseudomonas,芽孢杆菌Bacillus,苍白杆菌Ochrobactrum以及中慢生根瘤菌Mesorhizobium等细菌类群的生长,对短杆菌Brevibacterium,克雷白氏肺炎杆菌Klebsiella pneumoniae,根瘤菌Rhizobium sp等表现出抑制作用。生防菌T4对根围土壤中氨氧化细菌群落并没有产生明显的影响。可见,生防菌木霉T4引入初期对根围土壤中细菌群落产生明显的扰动,但这种干扰是短暂的,并没有对根围土壤细菌群落形成持续的影响。

生防菌株对地黄枯萎病的防治效果及其促生作用

从地黄根际土壤中分离到对地黄枯萎病菌有较强抑制作用的B6、B2 1、S15、S5 2、S72、S92、S95、T3和T4等9株生防菌。经盆栽试验和田间小区防治试验,结果表明,S15、S72、S5 2、B6和T4对地黄枯萎病的防效都达到了5 0 %以上,且S5 2、S15和S95对地黄具有明显的促生增产作用,具有较好的开发利用价值。

杨树溃疡病生防菌株的抑菌机理研究

黄绿木霉YGF9菌株和木贼镰刀菌LX6F2菌株分别为分离自杨树组织和杨树林土壤中的2株生防菌。为了研究黄绿木霉和木贼镰刀菌对杨树溃疡病菌葡萄座腔菌的生防抑菌机制,从生防菌株对病原菌代谢系统和生理生化的影响2个方面研究了生防菌株的抑菌机制。结果表明,两生防菌株发酵液的正丁醇提取物可降低病原菌菌体的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)与辅酶I的活性,使Na^+,K^+-ATP酶、Mg^(2+)-ATP酶和Ca^(2+)-ATP酶的活性急剧下降;两生防菌株可显著提高病原菌菌丝体的电导率和丙二醛(MDA)含量,降低病原菌蛋白质含量。说明两生防菌株可通过影响病原菌的代谢系统和生理过程来发挥其抑菌作用。

喷雾压力和药液流量对井冈·枯芽菌在水稻叶片定殖的影响

研究了施药机具不同工作压力和药液流量对生物农药井冈.枯芽菌在水稻叶片上定殖数量及活性的影响。盆栽试验结果表明:担架式机动喷雾机、机动弥雾喷粉机和背负式机动喷雾器对生防菌的活性无不利影响。其中担架式机动喷雾机工作压力超过2.5 MPa以上有利于生防菌的定殖;机动弥雾喷粉机同一风速挡、不同流量挡的处理中,流量挡达到2.0 L/m有利于生防菌的定殖。同时生防菌在水稻叶片上定殖数量与水稻纹枯病的防效呈正相关的关系。

番茄灰霉病生防细菌BAB-1的鉴定及发酵条件的优化

菌株BAB-1是从土壤中分离出的对番茄灰霉病具有较好防治效果的拮抗细菌。通过对该菌株进行形态特征观察、16SrDNA序列分析和API50CHB细菌鉴定试剂盒鉴定,确定菌株BAB-1为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。采用16种培养基对菌株BAB-1进行了发酵培养,结果表明,3号培养基最适合该菌株菌体生长和抑菌物质的产生。进一步进行了培养条件的优化,发现在培养温度30℃,转速210rpm,初始pH7.24,接种量3%,装样量为70mL/250mL时菌体生产量最高,菌量达到1.63×109cfu/mL;而在培养温度30℃,转速210rpm,初始pH7.24,接种量2%,装样量为100mL/250mL时最适合抑菌物质的产生,对番茄灰霉病菌的抑菌圈直径达到1.81cm。