Biocytin,一种新型细胞内示踪剂

Biocytin是生物素与赖氨酸的复合物,分子量为373,大约是辣根过氧化物酶的百分之一。分子量小和含生物素使得此化合物容易通过高阻抗玻璃微电极注入所记录的神经元内,并用常规的ABC方法显示。本实验在大鼠离体脑片上进行。将Biocytin泳入完成电生理观察的不同海马神经元内,ABC孵育,DAB呈色。结果看到,锥体细胞和颗粒细胞,被Biocytin显示呈Golgi样标记,中间神经元被Biocytin标记的轴突终末广泛而密集,其效果明显优于当前广泛用于细胞内标记的辣根过氧化物酶和Lucifer yellow。

Biocytin在在体脊髓细胞内标记中的应用

细胞内记录脊髓背角神经元之后，将玻璃微电极中的ｂｉｏｃｙｔｉｎ用去极化方波电流导入。切片经ＡＢＣ法孵育，ＤＡＢ呈色。标记细胞呈Ｇｏｌｇｉ样，胞体直径从数μｍ到数＋μｍ不等，形态各异；树突树完整，光滑或有棘；轴空有时可以显示，如出现串珠样轴突终末及侧枝则提示细胞标记完整。上述结果表明，在在体细胞内记录与细胞内标记相结合中，ｂｉｏｃｙｔｉｎ能够完整地显示所记录细胞的形态。特别是在用于标记中、小细胞有其独到之处。

三叉神经中脑核内假单极神经元的电生理和形态特性

为了探讨三叉神经中脑核(Vme)神经元的电生理和形态学特征,本研究应用红外可视脑片膜片钳技术、biocytin细胞内标记技术以及免疫组织化学染色方法观察大鼠Vme内假单极神经元的电生理和形态学特征。结果显示:(1)长时程去极化方波刺激能够引起Vme神经元重复放电,且根据放电模式的不同,可将其分为快适应型神经元和慢适应型神经元两种类型,其中快适应型神经元占绝大多数;(2)经biocytin细胞内标记并染色后,光学显微镜下观察两种类型的Vme神经元在形态上均为假单极神经元,无显著差别。以上结果提示:形态学类型相同的Vme神经元的电生理学特点具有多样性,这可能与Vme神经元担负复杂的口面部本体觉信息的传递功能有关。

大鼠视皮层神经元电生理和形态学特性在发育中的变化

为研究大鼠不同发育阶段视皮层神经元电的生理学与形态学特性 ,实验观察了神经元电生理和形态学特性的变化与年龄的同步化程度 ,探讨视皮层视觉依赖性突触的形成和重新分布的细胞内机制。应用脑片膜片钳全细胞记录技术和细胞内生物素标记相结合的方法 ,记录 4- 2 8dSD大鼠视皮层神经元的突触后电流 (postsynapticcurrents,PSCs)。共记录 15 6个大鼠视皮层神经元 ,睁眼前与睁眼后组中无反应型细胞数量 ,多突触反应型细胞数量、细胞的输入阻抗有显著性差异。成功标记 2 3例神经元 ,不同年龄的神经元的形态学成熟度不同。低输入阻抗神经元在形态学上属成熟型 ,高输入阻抗神经元属幼稚型。该结果表明 ,大鼠在发育过程中 ,视皮层神经元功能的成熟表现为在形觉刺激以及局部神经元网络的整合作用下的视觉依赖性突触的形成和重新分布。在视觉发育可塑性关键期内 。

大鼠发育过程中伏隔核神经元的电生理学和形态学特性

为探讨发育过程中伏膈核神经元的形态学和电生理学特性 ,运用脑片膜片钳全细胞记录技术结合细胞内标记技术对出生后 3 d(P3 ) 3 0 d(P3 0 )的伏隔核神经元进行了研究。结果表明 :出生后随着动物的不断成熟伏隔核神经元的树突野半径和树突总长度逐渐增长 ,树突分支逐渐增多 ;静息膜电位 (RMP)和输入阻抗 (IR)降低 ;动作电位的幅度升高 ,时程降低 ,突触后电流则无显著性变化。但在 P7以前 ,5 7.9%的神经元对刺激无反应 ,这类神经元主要见于幼稚动物 ,其静息膜电位与输入阻抗较高。提示 ,发育过程中伏隔核神经元的形态和功能成熟密切相关 ,幼稚与成熟神经元在细胞形态学和电生理学以及突触功能上的显著差异表明幼稚和成熟神经元对信号的输入、输出整合不同。

一种可用于500μm脑片的高分辨率细胞内标记技术

目的建立简便高效的、与脑片盲法膜片钳记录相结合的生物胞素细胞内标记染色方法。方法制备大鼠听皮层脑片(500μm),采用盲法脑片膜片钳全细胞记录,泳入生物胞素(0.2%)对记录细胞进行标记,经组织化学显色和甘油封片后,沿显微镜Z轴,每隔30μm拍摄一帧显微数码图像,利用Adobe Photoshop软件对神经元进行三维重建。结果标记的神经元层次清楚,可在光镜下分辨出胞体、轴树突分支、棘突等细微结构,而且非特异性背景染色浅;不需要进行厚脑片的二次切片即可对神经元进行三维重建。结论本方法简便易行,结果可靠,分辨率高,而且对设备要求不高。

大鼠出生后内侧膝状体腹侧部神经元电生理和形态学特性的发育变化

本实验采用脑片膜片钳全细胞记录和生物胞素(biocytin)组化染色相结合的技术,研究出生后(postnatal day,P)3～30日龄大鼠(P3～30)内侧膝状体腹侧部(ventral partition of medial geniculate body,MGBv)神经元的电生理和形态学特性的发育变化.结果显示:(1)在P3～30的发育过程中,MGBv神经元的静息膜电位自-40 mV降至-67 mV(P＜0.01);输入阻抗由1 832MΩ降至806 MΩ(P＜0.01);时间常数由2.55 ms降至0.96 ms(P＜0.01).同时,动作电位的幅度、阈值和时程也表现出显著差异(P＜0.01);(2)K+通道阻断剂4-AP使P6的MGBv神经元诱发动作电位数目减少,幅度降低,时程变宽,并使P16的动作电位幅度逐渐降低至去极化脉冲终末达到平台电位,而Ca2+通道阻断剂CdCl2仅引起P16的MGBv神经元动作电位的幅度降低,时程延长;(3)在用biocytin标记的MGBv神经元观察到,幼稚MGBv蓬丛样神经元(tufted neuron)胞体呈圆形或椭圆形,而随着出生后日龄的增长,胞体逐渐变成梭形.轴突出现较早,树突的发育相对较晚,但其发育变化更为显著和复杂.以上结果提示,大鼠出生后MGBv神经元电生理和形态学特性仍有显著的发育变化,且两者明显相关.

大鼠海马脑中枝形吊灯样中间神经元的形态与电生理学特征

在大鼠海马脑片标本上，用微电极记录并标记了４个校形吊灯样中间，约占所记录到的３９个中间神经元的１０％。与蓝状中间神经元显著不同之处是，这４个神经元均对细胞内去极化电流表现出不同程度的放电频率适应现象。用细胞内注射ｂｉｏｃｙｔｉｎ的方法证实，蓝状中间神经元轴突终末主要分布在锥体和颗粒细胞层，与这些细胞胞体形成接触；而４个枝形吊灯样中间神经元的轴突终末均高度选择性地分布在锥体和颗粒细胞轴突始段区。上述结果表明，枝形吊灯样中间神经元在形态和电生理方面均与蓝状中间神经元不同，它属于中间神经元的一个特殊类型。

成年大鼠视皮层(17区)神经元间的染色耦合──离体脑片研究

在离体脑片上，用生物胞素（biocytin）对成年大鼠视皮层神经元进行胞内注射。在标记成功的49例中，21例（42．9％）有染色耦合现象，耦合细胞的个数从2个到5个不等，平均2．8±1．1个。其中，18例为锥体-锥体神经元之间的耦合，2例为锥体-非锥体神经元之间的耦合，1例为非锥体神经元之间的耦合。在耦合细胞中，只有5例的胞体紧靠在一起，其它细胞的胞体之间都有一定的距离，其中有1例达到了635μm。大多数情况下（19／21例），耦合细胞的胞体位于同一层次内，只有2例胞体位于不同层次。在Ⅱ／Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ层内都观察到染色耦合神经元，但以Ⅱ／Ⅲ层内发生染色耦合的比率为最高。比较了染色耦合与非耦合神经元的某些电生理特性，没有观察到在它们之间有明显的差别。

大白鼠听觉皮层锥体神经元形态学特性的研究

以大白鼠为实验材料，利用Ｂｉｏｃｙｔｉｎ作为示踪素，在Ｖｉｔｒｏ水平上采用细胞内注入的方法，揭示其听觉皮层锥体神经元的形态学特性。

鱼类动眼神经的形态学研究

目的:应用生物胞素法观察罗非鱼动眼神经的形态分布。方法:本实验用罗非鱼,10只(性别不限),体长12-16 cm,动物浸入140 mg/L三卡因间氨苯酸乙脂甲磺酸盐{tricaine methanesulfonate(MS222)}溶液中麻醉,在手术显微镜下暴露动眼神经,通过生物胞素(Biocytin)结晶追踪技术研究定位硬骨鱼类动眼神经的形态分布。结果:①被标记的神经纤维长而粗细不等,排列比较松散,从后外向前内方向行走,逐渐靠近,终于位于中脑腹侧部的动眼神经核细胞,同时可以观察到有些神经纤维交叉到对侧。②神经核细胞呈圆形和卵圆形,大小不一,亦可见神经元的突起,有的突起呈螺旋状连于胞体,有的呈线状连于胞体,形成神经终末及突触联系,并可见到多极神经元,并在神经纤维之中也可以见到少数神经核细胞,但部分标记结构并不太完整,有些标记的神经细胞和神经纤维不是很清楚。结论:鱼类动眼神经纤维在中脑内的走行与其他动物基本一致,动眼神经核位于中脑水管腹侧部。

鱼类滑车神经的形态学研究

目的：应用生物胞素法观察罗非鱼滑车神经的形态分布。方法：本实验用罗非鱼，10只（性别不限），体长12～16cm，动物浸入140mg／L三卡因间氨苯酸乙脂甲磺酸盐{tricainemethanesulfonate（MS222）}溶液中麻醉，在手术显微镜下暴露滑车神经，通过生物胞素（Biocytin）结晶追踪技术研究定位硬骨鱼类滑车神经的形态分布。结果：①被标记的神经纤维长而粗细不等，平行致密排列，从后外下向前内上方向行走，逐渐上行，于中脑水管正中背侧部,进行交叉到对侧，终于中脑水管腹侧部的滑车神经核细胞。②神经核细胞呈圆形和卵圆形，大小不一，亦可见神经元的突起，有的突起呈螺旋状连于胞体，有的呈线状连于胞体，形成神经终末及突触联系，并可见到多极神经元。结论：鱼类滑车神经纤维在中脑内的走行与人类基本一致，滑车神经核位于中脑水管腹侧部。

鱼类三叉神经运动核的形态学研究

目的:应用生物胞素法观察罗非鱼三叉神经运动核的形态及细胞分布特征。方法:本实验用罗非鱼,15只(性别不限),体长12～16 cm,动物浸入140 mg/L三卡因间氨苯酸乙脂甲磺酸盐{tricaine methanesulfonate(MS222)}溶液中麻醉,在手术显微镜下暴露神经,通过生物胞素(Biocytin)结晶追踪技术研究定位硬骨鱼类三叉神经运动核的形态及细胞分布。结果:①硬骨鱼类罗非鱼的三叉神经运动核分为腹侧和背侧两组细胞群。②三叉神经根注入列中两组细胞群都能观察到被标记的细胞。下颌神经注入列中被标记的细胞以背侧群为主。上颌神经及眼神经注入列中两群细胞都没有发现被标记细胞,但上颌神经组中能观察到神经终末及突触联系。结论:硬骨鱼类罗非鱼的三叉神经运动核分为两组细胞群。三叉神经运动核发出的纤维走行于下颌神经内。