不同饥饿时段对黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)ghrelin基因表达的影响

设计了黑鲷ghrelin基因的特异性引物,提取胃组织总RNA并扩增出目的片段,将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体,经质粒PCR扩增、酶切和测序鉴定重组质粒,构建标准曲线等,成功建立了ghrelin基因荧光实时定量PCR检测方法,以准确分析ghrelin基因在黑鲷摄食调节中的作用。运用建立的荧光实时定量PCR方法检测了不同饥饿时段(2天、7天)黑鲷胃、肠、下丘脑组织中ghrelin mRNA的表达变化。结果表明,饥饿2天(短期饥饿),黑鲷胃、肠组织中ghrelin mRNA表达显著上升(P<0.05),下丘脑ghrelin mRNA表达无显著变化(P>0.05);饥饿7天(长期饥饿),黑鲷胃、肠组织ghrelin mRNA表达比饥饿2天显著下降,但仍显著高于对照组,下丘脑ghrelin mRNA表达逐渐升高(P<0.05);在同一饥饿时间内不同组织ghrelin mRNA表达存在显著差异(P<0.05)。黑鲷不同组织ghrelin基因的表达随不同饥饿时段呈现出不同的变化趋势,推测ghrelin基因参与了黑鲷摄食调节的生物学过程。

黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)肿瘤坏死因子α cDNA的克隆及特征分析

采用同源克隆的方法,从黑鲷中获得肿瘤坏死因子(TNFα)全长cDNA序列。该序列含1288个核苷酸,可编码253个氨基酸的TNF前体蛋白。它是一种跨膜蛋白,无糖基化位点和信号肽结构。黑鲷TNFα与其它鱼类的TNFα的相似性很高,占据进化上独立的分支;与哺乳类TNFα和TNFβ源于共同的祖先。基因结构分析显示,该基因含有TNF家族profile和TNF家族的标签序列;在参与TNFα基因二硫键形成的两个半胱氨酸和TNFα三聚体形成的位点高度保守;空间结构模拟显示,它与哺乳类TNFα的空间结构相似,都是由两个β折叠片组成,每个折叠片包含5个反向平行的β链。表达研究结果表明,黑鲷TNFα在检测的各个组织中均为组成型表达,表现为在刺激与非刺激鱼体中,都可以检测到黑鲷TNFα的表达,但是其表达水平在不同组织中有很大差异。黑鲷TNFα在头肾、脾脏和鳃的表达量较高,而在心脏、肝脏、血液、肾脏和大脑中表达量较低。

黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)CXC型趋化因子的体外表达及其生物学活性

采用 DNA 体外重组技术,将一个黑鲷 CXC 趋化因子基因亚克隆到 pQE30表达载体并转化到大肠杆菌(M15)中诱导表达后,利用 pn 递降的缓冲液从金属亲和柱洗脱含6xHis 标签蛋白的方法得以纯化,纯化产物的分子量约为8kDa,表达量约占蛋白总量的25%,以6xHis 单抗为一抗,采用 Western-blotting 方法鉴定获得的蛋白为目的蛋白。对表达产物进行生物活性鉴定表明,该蛋白具有显著的嗜中性粒细胞和巨噬细胞的趋化活性(P<0.01,P<0.05),它对嗜中性粒细胞和头肾巨噬细胞的趋化能力呈剂量依赖性,且对嗜中性粒细胞的趋化能力大于对头肾巨噬细胞的作用,还能诱导改变嗜中性粒细胞和巨噬细胞对细菌的吞噬活性,但对嗜中性粒细胞吞噬能力的改变小于巨噬细胞。该趋化性因子在结构和功能上属不完全 ELR+CXC 型趋化因子,兼具 ELR^+CXC 和 ELR^-CXC 趋化因子的活性,是一种不成熟 ELR+CXC 型趋化因子。

黑鲷DMRT1基因cDNA的克隆、组织表达谱及在性别逆转前后性腺中的表达

利用RT PCR和 3′ RACE的方法从黑鲷精巢中克隆了DMRT1基因cDNA的部分序列。组织特异性表达分析表明DMRT1基因只在精巢中表达。半定量RT PCR检测显示DMRT1基因在性别逆转前、性别逆转期和性别逆转后的精巢中的表达量无显著差异。在鱼类成体的精巢中 ,DMRT1的表达量可能不会因精巢结构或生理状态的改变而发生改变 。

黑鲷DMRT1基因cDNA片段的克隆和序列分析

根据其他鱼类DMRT1基因中的保守序列设计了一对简并引物 ,利用反转录 多聚酶链式反应 (RT PCR)的方法克隆了黑鲷 (Acanthopagrusschlegeli)DMRT1基因cDNA的一个片段 .该片段长 13 8bp ,推导的氨基酸序列由 45个氨基酸残基组成 .同源性分析表明 。

中国近海黑鲷线粒体DNA控制区序列多态性分析

采用聚合酶链式反应(PCR)和直接测序的方法,测定了广西北海、广东深圳和山东青岛3个地理群体共72尾黑鲷(Acanthopagrusschlegeli)线粒体Dloop第一高变区5′端547～549bp序列,以探讨黑鲷种群的遗传变异。分析结果表明:72条序列T、C、A、G4种核苷酸的平均含量分别为30.8%、21.8%、36.3%、11.0%。共检测到55个变异位点,其中转换位点32个,颠换位点19个,缺失/颠换位点1个,插入/颠换位点3个。72个个体具有51种单倍型(haplotype),单倍型比率为70.8%,黑鲷线粒体Dloop控制区表现出较为丰富的核苷酸多态性。对其所有单倍型依据序列距离使用NJ法构建的亲缘关系树并无明显的系谱分支,没有显示出明显的地理分布族群,说明黑鲷线粒体DNA控制区第一高变区序列无法用于黑鲷种群的鉴别。

急性低温对黑鲷抗氧化酶活性和热休克蛋白含量的影响

为探究急性低温胁迫对黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)生理机能的影响,以1龄黑鲷作为实验鱼,以15℃为对照组,设置10℃和5℃作为低温胁迫组,处理24 h后再转入15℃的水体中进行恢复实验,测定不同温度、不同时间点下1龄黑鲷肝的抗氧化酶活性以及热休克蛋白(Hsp)含量的变化。研究结果显示,低温胁迫实验中,低温处理组(10℃和5℃)在急性低温胁迫的24 h内,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性和热休克蛋白含量均呈现先上升后下降的趋势。10℃处理组上述三种抗氧化酶活性皆在12 h达到最大值,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性24 h恢复到对照水平,而谷胱甘肽过氧化物酶在18 h已经恢复到正常水平;在5℃处理组,超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性在6 h达到最大值,谷胱甘肽过氧化物酶在18 h达到最大值,且在24 h都仍与对照组有极显著差异,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性分别在恢复实验的12 h、12 h和6 h恢复到对照组水平。10℃和5℃两个处理组的热休克蛋白含量皆在胁迫18 h达到最大,10℃处理组在24 h恢复到正常水平,但5℃处理组的热休克蛋白含量直到恢复实验结束仍与对照组存在差异。本实验结果表明,急性低温胁迫对超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和热休克蛋白具有显著影响,其均呈现有规律的变化趋势,说明上述酶和蛋白参与了黑鲷的低温胁迫应答过程,通过协同调节黑鲷的生理机能使其适应环境变化,减少急性低温对鱼体的损伤并使其能够在环境骤变情况下存活下来。只有在自我调节范围内,黑鲷随着胁迫时间的延长,其体内才能够建立新的生理平衡来适应低温,因此在黑鲷养殖过程中,应当注意水温不宜低于5℃,水温过低时,应尽快将其移入室内,避免水温骤降对鱼体造成损伤。