应用组织工程口腔黏膜重建尿道的初步实验研究

目的探讨兔口腔黏膜细胞的体外培养方法,并以其为种子细胞与异体膀胱黏膜下脱细胞基质(bladder acellular matrix graft,BAMG)复合,构建组织工程尿道。方法18只10周龄雄性新西兰大耳白兔,体重0.3～0.5kg。取其中12只兔口腔黏膜组织,分离获得口腔黏膜细胞。将口腔黏膜细胞分别接种于有3T3细胞及无3T3细胞的培养皿进行培养,接种后第2天于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,绘制细胞生长曲线,观察生长增殖情况,并行免疫荧光组织化学染色鉴定。取余6只兔膀胱,经脱细胞处理制备BAMG,随机取1cm×1cm组织行HE染色,观察脱细胞效果。将接种于有3T3细胞培养皿培养获得的第2代口腔黏膜细胞种植于BAMG上,培养1周后,行HE染色及扫描电镜观察口腔黏膜细胞与BAMG的复合状况。结果倒置相差显微镜下观察,接种于有3T3细胞培养皿的口腔黏膜细胞可传至7～8代,其细胞形态均一,功能良好;无3T3细胞培养皿的口腔黏膜细胞形态多样,传至第2代时,即开始出现老化。细胞生长曲线显示,两种方法培养的口腔黏膜细胞均于第8天开始呈对数增长,第14天达峰值。接种于有3T3细胞培养皿的口腔黏膜细胞,培养至融合时所获得细胞数量明显多于接种于无3T3细胞培养皿的口腔黏膜细胞。两种方法培养的口腔黏膜细胞行免疫荧光染色,均呈绿色荧光。HE染色观察,BAMG经脱细胞处理后未见细胞,脱细胞效果良好。复合培养1周后,HE染色及扫描电镜观察口腔黏膜细胞与BAMG复合良好。结论兔口腔黏膜细胞可在体外成功培养、扩增,与同种异体BAMG复合后生长良好,为构建组织工程尿道提供了一种新的选择。

组织工程尿道粘膜的体外构建

目的:利用组织工程方法在体外构建形成尿道粘膜结构。方法:酶消化法获得猪膀胱尿路上皮细胞(UC),以免疫荧光和RT-PCR方法进行UC鉴定。制备膀胱脱细胞基质移植物(BAMG)作为支架材料,以苏木精-伊红染色、Masson染色、免疫组化和扫描电镜进行评价。经过体外培养和扩增后,将P3代UC接种在BAMG上。结果:BAMG支架上的UC经过体外培养1周后即可形成沿基膜排列的复层上皮结构。扫描电镜显示细胞-材料复合良好,免疫组化检测支架上的UC广谱角蛋白表达阳性。结论:运用组织工程方法能够在体外快速进行尿道粘膜上皮结构的初步构建,为进一步临床修复诸如尿道下裂、尿道狭窄等尿道缺损奠定技术基础。

无损光学法测量人胃粘膜/粘膜下层组织的光衰减特性

研究了人正常胃粘膜及粘膜下层组织对640 nm,690 nm,740 nm,790 nm,840 nm和890 nm波长的钛宝石激光的光衰减特性以及光学穿透深度,实验采用激光斜入射式空间分辨反射光和CCD探测器以及非线性拟合确定组织光学特性。结果表明:人正常胃粘膜及粘膜下层组织对六个波长的激光的有效衰减系数和光学穿透深度都是随着激光波长的变化而变化的。其有效衰减系数的最大值在640 nm,其值为1.12 mm-1,最小值在790 nm,其值为0.901 mm-1,最大差异在790 nm和890 nm之间,其值为19.9%,最小差异在690 nm和740nm之间,其值为2.83%。其光学穿透深度的最大值在790 nm,其值为1.11 mm,最小值在640 nm,其值为0.890 mm,最大差异在640 nm和790 nm之间,其值为24.7%,最小差异在690 nm和740 nm之间,其值为2.97%。

转染VEGF165的鼠膀胱平滑肌细胞种植小肠粘膜下层在大鼠膀胱重建中的应用

目的:了解转染VEGF165的鼠膀胱平滑肌细胞种植小肠粘膜下层在大鼠膀胱重建中的促血管生成作用.方法:将种植了转染VEGF的膀胱平滑肌细胞的小肠粘膜下层(SIS)体外培养后移植至大鼠体内,并以膀胱缺损自然愈合和单纯植入SIS为对照进行观察,于术后10wk内每隔2wk取标本进行组织学和免疫组化检测CD34和VEGFR2的表达,观察支架植入物的组织生长和修复情况.结果:膀胱缺损自然愈合组的大鼠术后1wk时膀胱缺损区已有膀胱移行上皮形成,第2周时新生的膀胱粘膜已覆盖缺损区.在植入SIS的两组动物中,术后1wk时炎性细胞浸润明显,可见膀胱移行上皮形成;术后2wk时炎性细胞减少,单纯SIS植入组和转染VEGF组均可见完整的上皮形成,两组未见明显的差异;此时已有新生毛细血管,VEGF受体的表达呈阳性,且转染VEGF组中新生毛细血管数量和VEGF受体的阳性表达细胞数高于单纯SIS植入组(P<0.05);术后4wk时新生毛细血管形成较第2周时明显增多(P<0.05),但两组间新生毛细血管数和VEGF受体表达阳性细胞数未见显著性差异,同时两组可见少量平滑肌纤维形成;术后6wk以后平滑肌形成逐渐增多,到第10周时可见明显的平滑肌束,两组间新生毛细血管数和VEGF受体表达阳性细胞数未见显著性差异.结论:转染VEGF165的鼠膀胱平滑肌细胞种植小肠粘膜下层在大鼠膀胱重建4wk内有促血管生成作用,6wk后两组新生毛细血管数和VEGF受体表达阳性细胞数未见显著性差异.

膀胱原发恶性淋巴瘤的临床病理特点、免疫表型和预后

目的 探讨膀胱原发恶性淋巴瘤的临床、病理组织学特点和免疫表型。方法 回顾性总结 7例膀胱恶性淋巴瘤的临床和病理组织学资料 ,免疫组织化学染色确定免疫表型。结果 6例原发性 ,1例继发性。 7例均为老年患者 ,女性 5例 ,男性 2例 ;6例原发性结外MALT型边缘区B细胞淋巴瘤 4例 ,弥漫性大B细胞淋巴瘤 2例 ,1例继发是弥漫性大B细胞淋巴瘤。结论 膀胱恶性淋巴瘤好发于 60岁左右的老年人 ,常见的临床表现是血尿和膀胱肿块。常见病理类型是弥漫性大B细胞淋巴瘤和结外MALT型边缘区B细胞淋巴瘤。

3-D多孔结构的小肠黏膜下组织在兔膀胱再生中的应用

目的探讨3-D多孔结构的小肠黏膜下组织(small intestine submucosa,SIS)在新西兰大白兔膀胱再生中的应用。方法用物理及化学方法制备具有3-D多孔结构的SIS。将24只雄性新西兰大白兔随机分为3组(n=8),分别行膀胱半切术建立膀胱缺损模型,使用3种不同处理的SIS进行膀胱重建。A组:未经过氧乙酸(peroxyacetic acid,PAA)处理的SIS组;B组:PAA处理的SIS组;C组:PAA处理后100%胎牛血清浸润的SIS组。3组在术前及术后4周测定膀胱容量,并于术后4周取材,行大体观察及组织学检测,评估膀胱再生情况。结果应用SIS行兔膀胱重建术后4周,3组再生膀胱组织与周围组织粘连依次降低,结石率分别为33.3%、28.6%、14.31%。与术前自身比较,术后4周3组膀胱最大容量均缩小且依次增加,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。术后组织学检测示3组膀胱上皮细胞均有再生,与A组比较,B、C组的上皮再生更好,边缘区和中心区无明显差异。3组膀胱平滑肌的再生均不理想,但边缘区平滑肌再生较中心区多;在边缘区和中心区,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。3组在边缘区和中心区的再生血管面积依次增加,3组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论经PPA及胎牛血清处理后3-D多孔结构的SIS,具有良好的促进膀胱组织再生能力,是一种比较理想的修复支架材料。

采用空间分辨漫反射测定胃组织光学特性

研究了人正常胃黏膜及黏膜下层组织对488 nm,514.5 nm,532 nm,630 nm和632.8 nm的激光的光学特性及其差异,实验采用空间分辨反射光和CCD探测器以及非线性拟合确定组织光学特性。结果表明,人正常胃黏膜及黏膜下层组织对五个波长的激光的吸收系数、约化散射系数、光学穿透深度、漫射系数、漫反射率和漫反射率的位移都是随着激光波长的变化而变化的。其吸收系数的最大值在532 nm,其值为0.482 mm-1,最小值在632.8 nm,其值为0.224 mm-1,最大差异在532 nm和632.8 nm之间,其值为115%,最小差异在488 nm和532 nm之间,其值为1.90%。其约化散射系数的最大值在488 nm,其值为5.93 mm-1,最小值在632.8 nm,其值为3.87 mm-1,最大差异在488 nm和632.8 nm之间,其值为53.2%,最小差异在514.5 nm和532 nm之间,其值为3.25%。其光学穿透深度的最大值在632.8 nm,其值为0.612 mm,最小值在488 nm,其值为0.341 mm。其漫射系数的最大值在632.8 nm,其值为0.084 mm,最小值在488 nm,其值为0.055 mm。其漫反射率的最大值在630 nm,其值为0.356,最小值在532 nm,其值为0.271。其Δx的最大值在632.8 nm,其值为0.153 mm,最小值在488 nm,其值为0.100 mm。可见,人正常胃黏膜/黏膜下层组织对五个波长的激光的光学特性参数存在明显的差异。

人膀胱粘膜／粘膜下层组织病变致组织漫反射光谱的变化

研究了人正常膀胱和浅表性膀胱癌的粘膜/粘膜下层组织在300～900nm光谱范围的漫反射光谱特性及其差异,实验采用带积分球附件的分光光度计获取组织的漫反射光谱。结果表明,在300～900nm,正常膀胱的粘膜/粘膜下层对任一个波长的漫反射率都明显地较癌变的粘膜/粘膜下层对相应波长的要大。正常膀胱的粘膜/粘膜下层的漫反射光谱的峰分别在370nm、520nm、550nm和660nm,其峰值分别为52.4%、60.7%、56.1%和75.5%。而癌变的粘膜/粘膜下层的漫反射光谱的峰分别在320nm、520nm、550nm和660nm,其峰值分别为43.7%、33.4%、30.6%和70.2%。正常膀胱的粘膜/粘膜下层的漫反射光谱在370nm处有一个峰,而癌变的粘膜/粘膜下层的漫反射光谱在370nm处没有峰,320nm处有一个峰。而正常膀胱的粘膜/粘膜下层的漫反射光谱在320nm处没有峰。膀胱的粘膜/粘膜下层病变导致组织的漫反射光谱在520nm、550nm和660nm处的峰的峰值分别减小了45.0%、45.5%和7.02%。说明膀胱的粘膜/粘膜下层病变导致组织的组分和结构尤其是组织中的氧合血红蛋白和去氧血红蛋白的含量发生了明显的改变。

组织工程补片膀胱扩大术治疗神经源性膀胱的疗效分析

目的 探讨使用小肠黏膜下层（small intestinal submucosa,SIS）组织工程材料补片行膀胱扩大术治疗神经源性膀胱的可行性和有效性. 方法 2011年1月至2014年3月收治14例神经源性膀胱患者,男10例,女性4例.年龄14～65岁,平均29岁.脊髓发育不良8例,脊髓损伤6例.尿动力学检查：最大膀胱测压容量平均为（150.1±64.2） ml,膀胱顺应性平均为（5.2±3.9）ml/cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa）,最大逼尿肌压力平均为（44.1±29.2） cmH2O.14例均接受SIS组织工程补片膀胱扩大术,术中将补片锁边缝合至纵向剖开的膀胱浆肌层,达到扩大膀胱的目的,其中7例同期行输尿管抗反流再植术.对术后并发症、影像尿动力学检查参数、尿路核磁水成像及肾功能进行观察评价. 结果 本组14例手术均顺利完成,手术时间平均为120 min.患者术后无代谢紊乱.复查肌酐水平均正常.术后随访6～48个月,平均24个月.尿动力学检查术后6、12、24个月最大膀胱测压容量分别为（274.9±88.7）、（322.5± 144.4）、（279.9± 157.9） ml,与术前比较差异有统计学意义（P＜0.05）;术后12、24个月最大逼尿肌压力为（20.1±9.8）、（20.2± 19.1） cmH2O,与术前比较差异有统计学意义（P＜0.05）;术后24个月膀胱顺应性为（26.1±29.4） ml/cmH2O,与术前比较差异有统计学意义（P＜0.05）.术后1个月,2例出现膀胱吻合口尿外渗,更换导尿管引流通畅后愈合.术后3个月,1例出现膀胱结石,行经尿道取石术后未再复发.术后12个月,4例出现膀胱输尿管反流,其中2例予膀胱逼尿肌A型肉毒素注射术,术后留置尿管3个月复查反流消失;2例保留导尿,口服琥珀酸索利那新（5 mg,2次/d）和酒石酸托特罗定（4 mg,1次/d）6个月后,1例反流消失,1例仍存在反流.结论 SIS组织工程补片用于膀胱扩大术可达到有效增加膀胱容量的目的.生物工程补片的使用为治疗神经源性膀胱提供了新的选择.

组织工程舌黏膜构建的研究

目的探讨舌黏膜细胞的体外培养方法，及其作为种子细胞与同种异体膀胱脱细胞移植物（BAMG）复合构建组织工程化黏膜的方法。方法分离并获取雄性新西兰大耳白兔舌黏膜细胞进行培养，定期观察细胞形态变化及生长增殖情况。对体外培养的舌黏膜细胞进行广谱角蛋白抗体（AE1／AE3）免疫荧光染色鉴定；流式细胞仪检测第2代培养细胞的AE1／AE3阳性细胞百分比；细胞计数及噻唑蓝（MTT）比色法测定以判断细胞增殖能力。取同种异体兔膀胱经脱细胞处理制成BAMG，随机取小块组织行HE和Masson染色观察脱细胞效果，然后将第2代体外培养的舌黏膜细胞种植于BAMG上，通过HE染色及扫描电镜观察口腔黏膜细胞与BAMG的复合情况。结果舌黏膜细胞形态均一有较强的增殖能力可传代至4～5代，传至第4代时开始出现老化，细胞贴壁及增殖能力均明显减弱。免疫荧光染色显示近100％体外培养的舌黏膜细胞AE1／AE3免疫荧光染色阳性。流式细胞仪检测结果表明第2代舌黏膜细胞AE1／AE3阳性细胞百分比大于96％。舌黏膜细胞传至第3代时可获得细胞数量在2×10^2以上。HE和扫描电镜观察均显示舌黏膜细胞和BAMG复合良好。结论兔舌黏膜细胞可在体外成功培养、扩增；兔舌黏膜细胞与同种异体BAMG复合后生长良好。