Advances and perspectives on cellular therapy in acquired bone marrow failure diseases

Acquired bone marrow failure diseases(ABMFD) are a class of hematopoietic stem cell diseases with a commonality of non-inherited disruption of hematopoiesis that results in pancytopenia. ABMFDs also are a group of heterogeneous diseases with different etiologies and treatment options. The three most common ABMFDs are aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Stem cell transplantation is the only treatment that can cure these diseases. However, due to high therapy-related mortality, stem cell transplantation has rarely been used as a first line treatment in treating ABMFD. With the advance of personalized medicine and precision medicine, various novel cellular therapy strategies are in trial to increase the efficiency and efficacy of ABMFD treatment. This article aims to review current available stem cell transplantation protocols and promising cellular therapy research in treating ABMFD.

外源性硫化氢通过Wnt/β-catenin信号通路促进衰老BMSCs的成骨分化

目的:探讨外源性硫化氢供体GYY4137对D-半乳糖(D-Gal)诱导的衰老骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨能力的影响及潜在机制。方法:应用不同浓度的D-Gal诱导BMSCs的衰老,CCK8法检测细胞活性及β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老的程度,确定D-Gal的最佳诱导浓度;应用不同浓度GYY4137进行干预后,检测GYY4137对正常BMSCs及衰老BMSCs细胞活性的影响,确定GYY4137最佳干预浓度。实验设CON组、GYY4137组、D-Gal组、D-Gal+GYY4137组,作相应处理后对各组BMSCs进行β-半乳糖苷酶染色,qRT-PCR法检测衰老相关基因(P16、P21、P53)和衰老相关炎症因子(IL-6、IL-8、TNF-α)的mRNA相对表达。对各组细胞进行成骨诱导分化,qRT-PCR法检测成骨分化相关因子碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、人骨形态发生蛋白2(BMP2)的mRNA表达,通过茜素红染色法检测钙结节形成数量,ALP染色法检测ALP的生成。通过转录组测序检测D-Gal组、D-Gal+GYY4137组两组细胞的差异表达基因,根据测序结果,qRT-PCR对差异基因进行验证。应用Dickkopf相关蛋白1(dickkopf Wnt signaling pathway inhibitor 1,DKK1)抑制Wnt10b的表达后,检测各组衰老BMSCs的成骨分化能力。结果:D-Gal的最佳诱导浓度为30 g/L,GYY4137的最佳干预浓度为10μmol/L,D-Gal组β-半乳糖苷酶阳性细胞比例显著增加,衰老相关基因(P16、P21、P53)及衰老相关炎症因子(IL-6、IL-8、TNF-α)mRNA的表达量显著升高(P<0.05或P<0.01),应用GYY4137干预后,以上细胞衰老相关指标显著降低(P<0.05或P<0.01)。在成骨分化过程中,D-Gal+GYY4137组ALP、OCN、RUNX2、BMP2的mRNA表达,钙结节阳性比例显著高于D-Gal组(P<0.05或P<0.01);测序结果发现Wnt/β-catenin信号通路中的Wnt10b表达有显著差异,qRT-PCR结果显示GYY4137可增加衰老细胞Wnt10b及其下游基因β-catenin的表达(P<0.05或P<0.01),与测序结果一致。应用100μg/L DKK1抑制Wnt10b的表达后,GYY4137处理的衰老BMSCs成骨分化相关基因ALP、OCN、RUNX2、BMP2的mRNA表达明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论:GYY4137可以缓解D-Gal诱导的BMSCs衰老进程,并且可能通过Wnt/β-cantenin信号通路促进衰老BMSCs的成骨分化。

骨髓间充质干细胞机械刺激成骨的记忆效应

背景:骨髓间充质干细胞作为组织工程的理想种子细胞,已证实力学刺激有引导其分化的作用。研究表明,干细胞存在着机械记忆,即力学刺激所引起的改变可能会长期影响干细胞的命运。目的:观察骨髓间充质干细胞对力学刺激的记忆效应,解析其发生的表观遗传学机制。方法:(1)分离原代小鼠骨髓间充质干细胞,检测其三系分化能力,传至第3代待用;(2)利用拉伸仪,体外给予小鼠骨髓间充质干细胞机械刺激,检测细胞拉伸前后的成骨分化情况;(3)流式细胞仪检测拉伸后细胞干性;(4)将拉伸处理与未处理的细胞消化后铺种在常规12孔板,继续培养14 d后检测细胞的成骨分化情况;(5)免疫荧光染色检测并筛选造成干细胞机械记忆的关键组蛋白修饰变化,初步明确表观遗传调控的可能机制。结果与结论:(1)5%形变,0.5 Hz,6 h/d,为期7 d的机械刺激可以引导小鼠骨髓间充质干细胞向成骨方向分化;(2)重新铺种培养皿后,拉伸处理后的细胞仍能保持干性且继续向成骨方向分化;(3)结果显示,骨髓间充质干细胞对机械刺激存在记忆效应,这种效应可能与力学刺激导致的组蛋白H3K4me3修饰有关。

1231例骨髓细胞形态学的诊断分析

目的:探讨骨髓细胞形态学改变及其对临床的诊断意义。方法:回顾性分析1 231例患者的骨髓检查,并对其细胞化学染色结果进行分析。结果:按细胞形态及细胞化学染色可将1 231例的患者分为,急性非淋巴细胞性白血病占11.9%,急性淋巴细胞性白血病占6.7%,溶血性贫血占3.3%,缺铁性贫血占13.0%,感染占11.2%等。结论:细胞形态学改变是诊断血液病学的重要指标,骨髓细胞学检查对确诊血液病是必要的。

补肝肾益气血方对^(60)COγ射线所致小鼠骨髓有核细胞周期及凋亡的影响

目的 探讨补肝肾益气血方对辐射损伤的防护作用机理。方法 设正常对照组、病理模型组、补肝肾益气血方高、低剂量组、阳性药物组 5组。补肝肾益气血组给予补肝肾益气血方 ,阳性药物组给予复方阿胶浆 ,其余给予生理盐水。灌胃 10天后 ,以6 0 COγ射线全身照射小鼠造成辐射损伤 ,观察补肝肾益气血方对辐照小鼠骨髓有核细胞细胞周期及调亡影响。结果 该方能使受照鼠骨髓有核细胞S期延长 ,G2期阻滞 ,显著提高造血细胞增殖指数。结论 补肝肾益气血方对6 0 COγ射线所致小鼠辐射损伤有较好保护作用 。

MR化学位移成像对血液病骨髓监测的初步研究

目的:本文旨在研究MR化学位移成像技术与血液病治疗中骨髓的细胞构成变化的相关性。材料和方法:35例确诊的恶性血液病病人通过MR化学位移成像及髂嵴穿刺活捡进行对照分析,测定骨髓化学位移率(CSR)、细胞构成变化和肿瘤浸润分数(TF)。同期30例无血液系统疾病病人进行了髂骨的化学位移成像及CSR测定,对血液病组和对照组分别进行定量均值计算及相关分析。结果:血液病组CSR为0.696±0.236,对照组CSR为0.422±0.159,血液病组与对照组间CSR的差异有统计学意义(P<0.01)。不同细胞构成比和不同TF的骨髓CSR组间差异显著(P<0.001)。Kendall等级相关提示CSR与细胞构成比、TF呈明显相关(P<0.01)。结论:MR化学位移成像能够监测血液病治疗后骨髓细胞构成的变化以及是否仍然存在肿瘤浸润。

脓毒症大鼠的白细胞和血小板的变化规律及发生机制

目的观察脓毒症大鼠白细胞(WBC)和血小板(PLT)的变化规律并探讨其可能的发生机制。方法 72只Wistar大鼠随机分为3组:对照组(n=8)、假手术组(n=8)、模型组(n=56)。模型组又分为7个亚组(每个亚组n=8);采用盲肠结扎穿孔术(CLP)复制脓毒症大鼠模型,观察每组大鼠一般情况、肺组织病理及WBC、PLT的变化。结果模型组大鼠病态表现明显,WBC、PLT的变化在假手术组与对照组间比较,差异无统计学意义(P>0.05),而模型组与对照组和假手术组间比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),模型组WBC、PLT的整体变化趋势均表现为先明显降低后缓慢回升。结论脓毒症大鼠WBC、PLT的异常变化可能与脓毒症时骨髓抑制、细胞趋化聚集或免疫功能紊乱的发生有关。

成人骨髓源性神经干细胞诱导分化实验研究

为探讨成人骨髓分离培养神经干细胞的可行性和有效性 ,无菌条件下行骨穿 ,梯度密度离心分离获取成人骨髓源细胞 ,以“CYTOKINE·神经干细胞培养液”培养 ,确定神经干细胞的最佳体外生存环境。以细胞克隆方法判断神经干细胞增殖情况 ;以NESTIN、NSE及GFAP免疫细胞化学方法分别鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。细胞培养所涉及的细胞因子主要有GDNF(2 0ng/ml)、LIF(10ng/ml)和RA(0 5 μg/ml)等。结果发现 ,成人骨髓源细胞在相应培养条件下快速分裂增殖为大而圆并含粗大胞质颗粒的神经干细胞 ,后者形成细胞球 (或称“神经球”) ,该细胞球表达特殊的神经干细胞NESTIN抗原 ;若进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养 ,单个的细胞又很快形成新的神经球。神经干细胞球进一步分化 ,可见到有的细胞胞体增大并出芽 ,逐渐发育成为较成熟的长突起细胞 ,长突起相互连接、交织成网并建立有神经纤维样联系 ,表达NSE或GFAP抗原。说明成年人骨髓在一定条件诱导下可以生成神经干细胞 ;

小鼠巨噬细胞功能极化可塑性的初步探讨

目的通过鉴定小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM)的功能表型,从而研究巨噬细胞功能极化的可塑性及其内在机制。方法采用流式细胞术检测体外诱导分化的小鼠骨髓来源巨噬细胞纯度;采用荧光定量PCR技术检测由RAW264.7极化的M1、M2巨噬细胞中M1、M2特定标记基因的表达来鉴定RAW264.7的功能状态;小鼠BMDM极化为M1、M2巨噬细胞时,荧光定量PCR技术检测M1、M2中特定标记基因TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1 mRNA水平的表达,组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A(TSA)、DNA去甲基化酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞(Aza)刺激M1、M2巨噬细胞后,检测TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1 mRNA水平表达的变化。结果 RAW264.7细胞经LPS刺激8 h极化为M1巨噬细胞;RAW264.7细胞经IL-4体外刺激24 h极化为M2巨噬细胞。小鼠BMDM在LPS、IL-4刺激下,分别极化为M1、M2巨噬细胞,改变体外刺激条件,M1巨噬细胞可重分化为M2样巨噬细胞,M2巨噬细胞可重分化为M1样巨噬细胞,M1样巨噬细胞和M2巨噬细胞是介于M1、M2中间状态的2种巨噬细胞;药物TSA、Aza的加入使M1、M2中特定标记基因TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1 mRNA水平表达增加。结论巨噬细胞的功能极化具有可塑性,巨噬细胞的极化可能与染色质状态的改变有关。

骨髓铁染色简化操作步骤的研究

目的:探讨更简单快捷的骨髓铁染色方法。方法:试验4%盐酸、40g/L亚铁氰化钾及2者等体积混合液3种方法固定外周血涂片及骨髓涂片的效果。对50例住院患者骨髓涂片分别采用常规方法和省略甲醇固定步骤的简化方法做铁染色,随机双盲观察细胞外铁和细胞内铁。结果:血涂片及骨髓涂片经4%盐酸和40g/L亚铁氰化钾的等体积混合液处理全部固定良好,而经4%盐酸、40g/L亚铁氰化钾作用全部未固定。经秩和检验比较50份骨髓涂片2种方法铁染色外铁及内铁结果无差异。结论:4%盐酸和40g/L亚铁氰化钾的等体积混合液对骨髓涂片除染色作用还兼有优良的固定作用;简化方法突显简单省时、省试剂、少污染的优点,适应临床即时性需求。

丹酚酸B对内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞联合心脏移植后增殖状况的影响

目的通过丹酚酸B预处理的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)与骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)混合后对心肌梗死大鼠进行心脏移植,观察移植细胞的增殖情况。方法密度梯度离心法和贴壁筛选法培养、纯化EPCs与BMSCs;免疫细胞化学法(CD34、CD133、CD44)分别鉴定2种细胞。采用左冠状动脉结扎法制作大鼠急性心肌梗死模型。丹酚酸B最佳药物浓度(8μg/mL)预处理EPCs,并以不同比例与BMSCs混合(EPCs/BMSCs分别为1∶1、2∶1、4∶1和8∶1),手术移植至心肌梗死区。HE和N-BT染色法检测心肌梗死面积;免疫组化法检测Ki-67的表达情况。结果与模型组(19.60%±3.23%)比较,各细胞移植组心肌梗死面积均明显下降(P<0.05),其中4∶1组(11.37%±2.18%)和8∶1组(9.23%±2.35%)效果最明显(P<0.05)。与模型组[(5.17±2.31)个/高倍视野]比较,各细胞移植组Ki-67阳性细胞数均显著增多(P<0.05),其中8∶1组阳性细胞数[(15.00±3.16)个/高倍视野]明显高于其他细胞移植组(P<0.05)。结论丹酚酸B预处理的EPCs联合BMSCs进行心脏移植,能够减少大鼠心肌梗死面积,提高BMSCs在梗死周边和缺血局部的增殖。并且随着EPCs移植比例的增加,梗死面积逐渐减少,增殖表达逐渐增强。

移植治疗骨质疏松研究进展

随着人口老龄化,我国已居世界骨质疏松症患者数量的首位。目前针对原发性骨质疏松的治疗大部分是通过药物改善症状,尚没有研究出快速而确切的疗法。本文综述了近十年来对于骨质疏松发病机制和新的治疗方法探索的新进展。其中,从细胞水平对骨质疏松的发病机制研究表明,骨质疏松的发生与干细胞机能紊乱密切相关。干细胞以及骨髓基质机能紊乱以及功能不足,导致多种促进成骨的因子生成不足,引起成骨细胞生成障碍、破骨细胞和脂肪细胞生成活跃,进而导致骨量减少、骨组织显微结构的异常形成骨质疏松。对于骨质疏松细胞水平发病机制的研究,促使了包括骨髓移植、干细胞移植、成骨细胞移植在内的应对骨质疏松新策略的产生。研究者尝试补充功能结构完整的骨髓、骨髓基质、干细胞、成骨细胞等进入骨质疏松者体内,从而调节机能紊乱、补足功能和成骨诱导生长因子的不足,以此达到预防和治疗骨质疏松的目的。

成人骨髓间充质干细胞体外向视网膜细胞的诱导分化

目的研究取材于成人骨髓的间充质干细胞在一定诱导条件下向视网膜神经细胞的分化。方法成人骨髓经密度梯度离心得到的细胞,根据其高黏附特性体外培养获得间充质干细胞。利用流式细胞仪分析其细胞表型,在体外诱导使其向视网膜神经细胞分化并用免疫荧光法进行鉴定。结果从骨髓中分离培养的细胞具有成纤维细胞样形态,贴壁生长,表型相对均一,表面标志为CD90、CD44、CD147阳性;而CD34、CD38、CD45、CD14、HLA-DR阴性。体外诱导后可以得到表达nestin(神经干细胞标志物)、GFAP(神经胶质细胞标志物)和Rhodopsin(视网膜光感受器细胞标志物)阳性的细胞。结论从人骨髓中分离培养得到的间充质干细胞具有向视网膜神经细胞分化的潜能。

骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的探讨大鼠骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化后超微结构和细胞因子表达的变化,为下一步细胞移植治疗扩张型心肌病提供理论依据。方法在体外扩增、定向诱导骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化的基础上,电镜下观察骨髓基质干细胞诱导前后超微结构的改变,RT-PCR检测心肌特异性因子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC的表达,并与原代培养的心肌细胞比较,观察二者之间的生物学异同。结果免疫组化法证实诱导后的骨髓基质干细胞向心肌样细胞分化,电镜下胞浆内可见糖原颗粒,肌原纤维排列与原代培养的心肌细胞相似;RT-PCR证实诱导后的骨髓基质干细胞表达心肌特异性因子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC。结论骨髓基质干细胞经5-氮胞苷定向诱导后在超微结构和细胞因子的表达上类似于心肌细胞,已向心肌样细胞分化。

不同配比纳米羟基磷灰石/聚己内酯复合材料细胞相容性的研究

目的:观察不同配比nPCL/HA电纺纤维取向薄膜材料的细胞相容性。方法:将人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)体外诱导培养为成骨细胞;并经传代培养第5代的人骨髓间充质干细胞,以2×105cm2的密度与不同配比nPCL/HA电纺纤维取向薄膜支架在培养板内共培养,同时以nPCL电纺纤维非取向薄膜材料作为对照,初步观察hBMSCs在不同配比nPCL/HA支架材料上复合培养,对其细胞相容性进行评价。结果:hBMSCs与3种电纺薄膜支架材料均有细胞相容性,细胞能在不同材料表面黏附生长、分化增殖。但是PCL/HA的配比为20:1电纺纤维取向薄膜材料黏附率(35.3±2.6)%,为3中材料中黏附率最高的一种,材料表面细胞生长良好,体积变大,有伪足生长。结论:PCL/HA的配比为20:1电纺纤维取向薄膜材料,较适合作为支架材料应用于hBMSCs为种子细胞的组织工程构建。

雷公藤总甙对细胞免疫应答的抑制作用及抗移植排斥作用

研究雷公藤总甙对细胞免疫应答的抑制作用及抗移植排斥作用。结果表明：雷公藤总甙可明显抑制异型小鼠脾细胞诱导的迟发型超敏反应，抑制混合淋巴细胞反应及抑制杀伤性Ｔ淋巴细胞杀伤靶细胞活性，进一步研究表明．雷公藤明显抑制Ｔ细胞对丝裂原ＣｏｎＡ的增殖反应，说明雷公藤抑制细胞介导的免疫应答，应用小鼠异基因骨髓移植模型研究发现，雷公藤具有明显的抗移植物抗宿主病作用。

煅烧骨的安全性(英文)

背景:经高温处理的煅烧骨具有类似自然骨的连续微孔结构,良好的生物相容性和降解性。目的:观察牛煅烧骨的生物相容性、细胞相容性及毒性。方法:①细胞相容性实验:将牛煅烧骨与第3代已诱导的Wistar大鼠骨髓间充质干细胞复合培养。②溶血实验:将煅烧骨浸提液、生理盐水与双蒸水加入兔血中。③凝血实验:将煅烧骨加入兔血浆中。④急性毒性实验:在昆明种小鼠尾静脉分别注射煅烧骨浸提液、生理盐水。⑤微核实验:在小鼠腹腔分别注射煅烧骨浸提液、生理盐水与环磷酰胺。⑥局部刺激性实验:将煅烧骨浸提液、生理盐水分别注射于兔两侧脊柱皮下。⑦热源检测实验:在兔耳静脉注射煅烧骨浸提液。⑧皮下植入实验:将煅烧骨材料植入Wistar大鼠背部皮下。结果与结论:煅烧骨材料无细胞毒性,具有良好的细胞及血液相容性;对皮肤、肌肉无刺激作用;对心、肝、肾重要器官无毒性作用;皮下植入后对周围组织无刺激作用,能够部分降解吸收并被机体组织替代;无致热作用,对凝血功能无影响,对小鼠骨髓细胞无抑制及毒性作用。

不同密度骨髓间充质干细胞移植对家兔股骨头缺血性坏死的治疗作用

目的比较不同密度的骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植,对实验性家兔股骨头缺血性坏死(ANFH)的治疗作用,探索合适的BMSCs移植密度。方法选取成年健康新西兰大耳白兔40只,根据BMSCs移植密度随机分为1×104(A),1×105(B),1×106(C),1×107(D),1×108(E)/ml BMSCs5组。对术后2、4、6、8周的股骨头标本,进行X-射线检查、组织学观察和图象分析。结果X-射线观察显示:随着时间的进展,各组钻孔区密度逐渐增加,A组密度增加不均,8周时,B、C、D、E组钻孔区呈现正常的骨小梁结构,A组部分钻孔区域呈现低密度腔隙。组织学观察表明:术后2周时,各组钻孔区内出现大量的成骨细胞,A组钻孔区中心为炎性细胞;8周时B、C、D、E组钻孔区内,骨小梁趋于成熟。A组钻孔区内分布有不均匀的骨小梁和骨髓组织。图像分析表明:在B、C、D、E组钻孔区内骨小梁的面积百分比值明显高于A组。结论体外培养的BMSCs移植修复ANFH时,不宜选择104以下的密度级别,应该尽可能提高移植细胞的密度。

补肾活血中药对免疫介导再障小鼠骨髓CD_(45)^+细胞的影响

目的 :观察补肾活血中药对免疫介导再障小鼠CD+4 5细胞的影响。方法 :建立免疫介导再障小鼠模型 ,随机分组胃饲生理盐水、高剂量中药、低剂量中药、环孢素A(CsA) ,并设正常对照 ,第 10d分别称体重、计算外周血细胞和骨髓有核细胞数、采用流式细胞技术测定骨髓CD+4 5细胞。结果 :中药组小鼠体重、外周血细胞、骨髓有核细胞数、骨髓CD+4 5细胞显著高于空白模型组和CsA组 ,而接近正常对照组。结论

复方苦参注射液联合同期放化疗治疗局部晚期鼻咽癌的疗效及其对患者免疫功能的影响

目的观察复方苦参注射液联合同期放化疗治疗局部晚期鼻咽癌的疗效及其对患者免疫功能的影响。方法将2012年6月至2015年6月在西安交通大学第二附属医院肿瘤科门诊诊治的82例局部晚期鼻咽癌患者按照随机数法分为观察组42例和对照组40例,对照组采用顺铂3周化疗方案联合同期调强放射治疗(IMRT),观察组在对照组治疗的基础上加用复方苦参注射液20 m L静脉滴注,1次/d,连续14 d,停药7 d为一个周期,连续治疗3个周期。治疗前1 d及结束后1周观察并比较两组患者各项细胞免疫指标(CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+)的变化情况;两组患者治疗过程中骨髓抑制最高等级反应程度;治疗结束后3个月时两组治疗的近期效果。结果所有的患者均完成放疗计划。观察组患者治疗后的CD4+水平较治疗前升高[(42.93±10.78)%vs(36.00±10.21)%],CD8+降低[(24.42±9.79)%vs(29.73±8.25)%),CD4+/CD8+比值升高(2.10±1.32 vs 1.38±0.83),观察组治疗后的细胞免疫功能水平优于其治疗前水平,差异均有统计学意义(P<0.05);观察组患者治疗后的CD4+、CD4+/CD8+增加量高于对照组[(6.65±1.34)%vs(-5.09±1.38)%、(0.56±0.15)vs(-0.57±0.16)],CD8+降低量高于对照组(-3.86±1.51)%vs(7.03±1.54)%,观察组治疗结束后细胞免疫功能水平优于对照组治疗后水平,差异均有统计学意义(P<0.05);观察组骨髓抑制程度低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);两组患者的近期疗效比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论复方苦参注射液虽未能提高局部晚期鼻咽癌同期放化疗近期疗效,但能有效激活患者的细胞免疫功能,减轻局部晚期鼻咽癌同期放化疗对骨髓的损伤,值得临床推广应用。