人参总皂甙对小鼠骨髓基质细胞RNA表达及其细胞因子诱生的影响

采用胶片法（细胞贴壁胶片生长法）及放射自显影等技术，较系统地观察了人参总甙（ＴＧＳ）对小鼠骨髓基质细胞ＲＮＡ表达的时相特点及对细胞因子ＩＬ－３、１１－６诱生的影响。结果表明．ＴＧＳ在体外对小鼠骨髓基质细胞ＲＮＡ的代谢有明显的促进效应．并且发现骨髓基质细胞实验上清中ＩＬ－３、ＩＬ－６因子的活性显著高于正常对照组。在此基础上。又利用放射自显影技术做为胶片法可行性的佐证．取得满意结果。

氟脲嘧啶促进Egr-1启动子上调人骨髓基质细胞GM-CSF的表达

目的:探索氟脲嘧啶(5-FU)对Egr-1启动子上调人骨髓基质细胞造血因子GM-CSF表达的促进作用,以寻找促进化疗所致造血损伤恢复的方法。方法:构建携带Egr-1调控序列启动的GM-CSF和EGFP双顺反子基因的重组真核表达载体(pCIneo-Egr-1-EGFP-IRES-GM-CSF,Egr-EG),通过脂质体转染骨髓基质细胞系HFCL,挑出G418抗性的阳性克隆(HFCL/EG)。采用RT-PCR检测5-FU处理的HFCL/EG细胞GM-CSFmRNA表达,用FACS和倒置荧光显微镜观察5-FU诱导HFCL/EG细胞EGFP表达的阳性细胞。在加入5-FU的HFCL/EG细胞培养体系中,用ELISA方法检测GM-CSF的含量;将从脐血中分离的单个核细胞接种于5-FU处理后的HFCL/EG培养上清液培养基中,观察其对GM-CFU的增殖作用;采用活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸检测5-FU通过活性氧诱导Egr-1启动子CArG序列调控下游基因表达的特异性。结果:构建了Egr-1调控序列启动的双顺反子基因表达载体Egr-EG,获得其转染细胞HFCL/EG。在5-FU处理的HFCL/EG细胞中,RT-PCR显示其GM-CSFmRNA表达增强,流式细胞术证实有EGFP的显著表达。在5-FU处理后,HFCL/EG细胞培养上清液GM-CSF含量和GM-CFU形成数量分别较未处理细胞能明显增高(P<0.01);在5-FU处理的HFCL/EG细胞中,N-乙酰半胱氨酸能明显减少GM-CSF含量(P<0.01)。结论:5-FU能促进Egr-1启动子上调人骨髓基质细胞GM-CSF基因的表达,从而对化疗后的造血损伤产生一定的恢复作用。

大鼠BMSCs成骨诱导及复合支架材料构建组织工程骨组织的研究

目的利用诱导成骨分化的骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)复合生物支架材料构建组织工程骨组织。方法采用密度梯度离心法获取大鼠骨髓间充质干细胞,原代培养扩增后,条件培养基诱导成骨分化作为实验组,并设非条件培养基培养为对照组。诱导培养后,通过碱性磷酸酶、钙结节染色;I型胶原、骨钙素检测鉴定成骨性。将诱导的BMSCs利用滴加法种入自制组织工程生物支架复合培养,采取扫描电镜、HE切片染色观察培养8天时细胞在支架内部的生长情况。结果密度梯度离心法获取培养的原代骨髓间充质干细胞呈梭形或三角形贴壁生长,以梭形为主;经成骨诱导剂诱导后细胞呈多角形贴壁生长,碱性磷酸酶染色呈阳性、茜素红染色出现阳性的钙化结节;Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组明显增加(<0.05);ELISA法检测骨钙素结果较对照组明显升高(<0.01)。HE切片染色可见支架内部有细胞长入,细胞呈圆形或椭圆形。扫描电镜可见支架内部有大量细胞长入,细胞粘附、生长良好,呈现完全伸展状态,细胞-支架-细胞之间有基质连接。结论本实验获取的原代细胞为骨髓间充质干细胞,诱导剂诱导后成功分化为成骨细胞。采用经诱导成骨后的细胞作为组织工程骨构建的种子细胞,与三维支架材料复合后共培养,使构建的组织复合物更接近骨组织,为临床大段骨缺损的修复增加可能性。

骨髓基质细胞CD105在异基因造血干细胞移植后植入不良与良好的表达差异

目的观察异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,alloHSCT)后植入不良患者与植入良好患者间骨髓基质细胞上黏附分子相关抗原的表达情况。方法收集陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院血液科2016年118例行allo-HSCT患者,根据移植后植入状态将其分为植入良好(good graft function,GGF)组和植入不良(poor graft function,PGF)组,比较两组患者在年龄、原发病、干细胞来源、HLA配型、性别匹配、ABO血型匹配、移植前骨髓增生程度及复发率、病死率等方面的差异;选取其中28例移植后植入不良患者作为研究组,植入良好患者27例作为对照组,提取其行移植术前骨髓活检标本做免疫组织化学染色,抗体选择CD44、CD105、CD29、ICAM-1、VCAM-1,比较上述黏附分子的表达。结果 PGF组与GGF组在年龄、原发病、干细胞来源、HLA配型、性别匹配、ABO血型匹配、移植前骨髓增生程度等因素差异均无统计学意义(P>0.05),而PGF组移植后CMV感染率显著高于GGF组,PGF组移植前缓解率显著低于GGF组,差异均有统计学意义(P<0.05)。经Cox回归分析显示,allo-HSCT后出现PGF的患者生存率明显低于未出现患者(P<0.05,HR=3.598);研究组免疫组化染色CD44、CD29、ICAM-1、VCAM-1表达情况与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),CD105表达水平明显高于对照组(P<0.05)。结论 allo-HSCT后出现植入不良的患者生存率显著下降;移植后植入不良的发生可能与移植前骨髓基质细胞CD105表达升高有关。

神经生长因子在高糖环境下对骨髓基质细胞成骨活性的影响

目的探讨神经生长因子(NGF)在持续稳定高糖环境下对骨髓基质细胞(BMSCs)成骨活性的影响。方法取4周龄雄性SD大鼠四肢骨骨髓,全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs,实验分三组:正常糖组(葡萄糖浓度为5.5mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度为25mmol/L)、高糖+NGF组(葡萄糖浓度为25mmol/L,NGF100ng/ml)。通过检测细胞增殖、定量检测碱性磷酸酶(ALP)的表达及茜素红矿化结节染色,观察NGF对高糖环境下BMSCs成骨活性的影响。结果 (1)细胞增殖:高糖环境可明显促进BMSCs的增殖作用(P<0.05);NGF对24h内高糖环境下细胞增殖有抑制作用(P<0.05)。(2)ALP的表达:高糖组与正常糖组相比,高糖环境对细胞ALP的表达无明显抑制作用(P>0.05);高糖+NGF组与高糖组相比,NGF对在高糖环境下对细胞ALP的表达没有明显的促进作用(P>0.05);高糖+NGF组与正常糖组相比,第5天时,正常糖组(0.33±0.03)与高糖+NGF组(0.31±0.01)差异有统计学意义(P<0.05),高糖+NGF组仍较正常糖组表达量低。(3)钙结节量:正常糖组>NGF+高糖环境组>高糖环境组。结论持续稳定高糖环境可促进BMSCs的增殖,对其早期分化无明显抑制作用,但明显抑制了BMSCs矿化。NGF在持续稳定高糖环境下可促进BMSCs的矿化作用,但仍较正常水平差。