CD46基因在家畜抗病育种中的应用研究进展

补体调节蛋白46(complement regulator protein, CD46)在大多数哺乳动物的细胞上广泛表达。除了具有补体失活、调节T细胞活化和生育能力等多种生理功能之外,CD46也可以作为多种细菌和病毒的受体,尤其对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)和经典猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)的附着起重要作用。利用基因编辑技术特异修饰CD46成功生产出抗BVDV活牛犊,证明该基因可以作为抗病育种的候选基因。本文主要对CD46蛋白在家畜病毒感染中的作用以及在抗病育种中的应用进行综述。

4种致牛腹泻病毒多重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRV)、牛恶性卡他热病毒(MCFV)4种致牛腹泻病毒多重荧光定量PCR检测方法,为BVDV、BCoV、BRV和MCFV的鉴别诊断提供技术支持。【方法】根据BVDV的5′UTR基因、BCoV的N基因、BRV的VP6基因和MCFV的ORF9基因的保守区域设计引物,克隆目的基因构建标准阳性重组质粒,建立可同时检测4种致牛腹泻病毒的多重荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。用建立的多重荧光定量PCR检测方法对76份临床样品进行检测,并与常规PCR检测方法的结果进行比较。【结果】建立了BVDV、BCoV、BRV和MCFV多重荧光定量PCR检测方法,该方法建立的标准曲线线性关系良好,仅可特异性扩增出4种目标基因片段;对BVDV、MCFV、BRV和BCoV的最低检出限分别为9.4×10^(1),1.4×10^(3),9.1×10^(1)和1.2×10^(2)拷贝/μL,与普通PCR相比,灵敏性高出10~1000倍;批内、批间差异均小于5%。76份临床样品检测结果显示,多重荧光定量PCR检测结果与普通PCR检测结果的符合率分别为98.7%(BCoV)、97.4%(BRV)、100.0%(BVDV)和100.0%(MCFV)。【结论】建立了BVDV、BCoV、BRV和MCFV多重荧光定量PCR检测方法,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牛腹泻病毒病原的实验室检测。

牛病毒性腹泻病毒、牛传染性支气管炎病毒和口蹄疫病毒多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立同时快速鉴别检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性支气管炎病毒(IBRV)和口蹄疫病毒(FMDV)的方法,本研究根据高度保守的BVDV的5'UTR基因、IBRV的g B基因和FMDV的3D基因,分别设计了3对对应的特异性引物和3种不同发光基团标记的Taq Man探针,建立了同时检测这3种病毒的多重荧光定量PCR的方法。并对其反应条件进行优化。结果表明,该多重荧光定量PCR方法能够特异性检测出BVDV、IBRV和FMDV,而对BTV等检测结果均为阴性,对BVDV、IBRV、FMDV的最低检测量分别为194拷贝/μL、208拷贝/μL和150拷贝/μL。而且组内和组间变异系数均低于0.85%。本研究所建立的多重荧光定量PCR具有方便、快速、特异性好、灵敏度高、重复性好等优点,能够用于BVDV、IBRV和FMDV的同时检测。

几种动物病毒的基因芯片检测技术

分别用水疱性口炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒各一段高度保守的基因片段构建质粒 ,在此基础上制备了芯片探针。提取样品中的核酸 ,经反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交 ,对杂交结果扫描检测 ,可同时对上述 7种动物传染病进行快速、准确的诊断 ,此方法敏感性高 ,特异性强 ,适合于大批动物高通量检疫。

牛病毒性腹泻-黏膜病诊断方法研究进展

牛病毒性腹泻-黏膜病是由黄病毒科、瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒引起的一种传染性疾病。该病以发热、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、腹泻、怀孕母牛流产或产畸型胎儿为主要特征。该文就近几年来国内外对该病的实验室诊断方法,包括病毒分离、血清学试验、电镜观察、免疫荧光技术、聚合酶链反应技术等的研究概况进行了综述。

新疆部分地区牛病毒性腹泻-黏膜病病毒的分离鉴定

【目的】了解新疆地区BVDV毒株的生物型和基因型。【方法】采集新疆石河子和伊犁地区疑似感染病毒性腹泻-黏膜病病毒牛的新鲜粪便174份,应用RT-PCR方法对其进行检测,将检测结果为阳性的样品接种于MDBK细胞上培养,电镜观察,测定毒价,使用RT-PCR方法对细胞培养物进行鉴定,并提取质粒进行测序,对结果分析。【结果】该毒株可使MDBK细胞发生病变,扩增出一条286 bp目的片段,经同源性和遗传进化分析,确定为BVDV-1型毒株。【结论】分离到一株BVDV-1型新疆毒株,可使MDBK细胞发生病变,病毒粒子直径约为20~40 nm,毒株TCID5010-4.5/0.1 m L。

牛病毒性腹泻病毒致病机制研究进展

牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea,BVD)和黏膜病(mucosal disease,MD)均是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染引发的传染病,严重威胁世界养牛业的发展。文章概述了BVDV分型及其分子生物学特征,并从急性感染、经胎盘或子宫感染、持续性感染和黏膜病4个方面总结了近期国内外BVDV致病机制的研究进展。根据序列保守性及是否致细胞病变可将BVDV分为两种基因型和两种生物型,其中,新发现的"HoBi"株归类为瘟病毒属。BVDV基因进化很快,基因组编码4种结构蛋白和8种非结构蛋白,编码蛋白在病毒的复制、翻译及在宿主致病过程中发挥重要作用。BVDV致病机制复杂,急性感染会造成病毒血症、繁殖障碍、免疫抑制等,急性感染牛发生腹泻的原因与BVDV感染胃肠道的肌层、黏膜下层并干扰肠道神经的正常功能相关,非致细胞病变型(NCP)BVDV是造成急性感染的病因。胚胎感染BVDV取决于病毒首次侵袭时胎儿在子宫内的生长阶段。NCP型BVDV具有抑制胎儿体内产生Ⅰ型干扰素的能力,致使该病毒在宿主中得以生存并形成持续性感染牛,当持续性感染牛再次感染与NCP型BVDV高度同源的致细胞病变型(CP)毒株时直接诱发黏膜病。两种生物型的产生是发生持续性感染和黏膜病的重要因素,NCP型可向CP型BVDV进行转化。本综述有助于发现控制BVD-MD传播的新途径,为消灭该病和新型疫苗的研制提供参考。

牛病毒性腹泻/黏膜病病毒河北分离株的生物学特性

【目的】了解牛病毒性腹泻病毒河北分离株HB株的特性,阐明牛病毒性腹泻/黏膜病致病机理,更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据特进行此项试验;【方法】用理化学及生物学方法对BVDV河北分离毒株HB的特性进行检测,与BVDV准毒株OregonC24V株进行比较,分析了其理化性及生物学特性。电镜负染检查可见直径为40￣60nm有突起的圆形或近圆形的病毒颗粒,病毒在蔗糖中的浮密度为1.13￣1.14g/cm3。与牛病毒性腹泻-粘膜病病毒颗粒相似。毒力测定TCID50为10-4.5。理化学研究表明,该病毒对氯仿、乙醚、胰酶敏感;不耐酸、对碱具有较强的耐受性。牛病毒性腹泻/黏膜病病毒对56℃30min较敏感,56℃70min可使其完全灭活。血凝试验表明,该病毒对鸡、兔、猪和绵羊的红细胞均无血凝性;5-碘脱氧尿核苷(5,-IUDR)不能抑制病毒的增殖,核酸分型试验表明该病毒株基因组为RNA;病毒纯化后经SDS—PAGE电泳出现了5条主要结构蛋白带,与BVDV国际标准毒株OregonC24V株结果一致;【结论】河北分离株HB株为牛病毒性腹泻病毒。

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E2基因在卡介苗中的优化表达

为构建牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)基因工程活载体疫苗,根据已知的BVDV Changehun184毒株E2基因序列,利用DN.AStar生物学软件对其进行分析,预测了可能存在的抗原表位,设计6对引物,分别扩增了包含预测抗原位点的6个片段,1—297 aa、1—345 aa、1—374 aa、45—297 aa、45—345 aa和45—374 aa,克隆至穿梭表达载体pMV361中,经酶切、PCR扩增和测序证实已正确插入到表达载体中,构建了6个原核表达质粒。阳性重组质粒通过电转化到卡介苗(BCG)感受态中,热诱导后,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹检测。结果表明6个重组质粒在卡介苗中均有不同程度的表达,表达产物与理论推测的相对分子质量一致。Western blot结果显示其融合蛋白能被牛抗BVDV的阳性血清识别,具有相应的反应原性。本研究为进一步研究BVDV基因工程活载体疫苗奠定了基础。

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E2基因重组卡介苗初步免疫研究

为评价表达牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)E2基因重组卡介苗(rBCG)的初步免疫效果,本研究分别将rBCG-pMV261-E2和rBCG-pMV361-E2免疫实验用大耳白兔,通过间接ELISA方法和T淋巴细胞转化试验分别检测兔体内体液免疫和细胞免疫应答水平。结果显示在体液免疫方面,两组rBCG均从第7 d开始产生BVDV抗体,抗体水平逐渐上升,在42 d达到峰值,并且rBCG-pMV361-E2刺激所产生的抗体水平始终高于rBCG-pMV261-E2;而rBCG血清中的抗结核菌抗体水平与正常BCG无显著差异,与BVDV阳性对照组和阴性对照组之间则差异显著;在细胞免疫方面,与阴性对照组相比,两组rBCG与BVDV灭活苗相同,免疫实验兔后淋巴细胞对特异性刺激均有明显的增殖。表明两组rBCG免疫实验兔后均使其产生了体液免疫应答和细胞免疫应答,为进一步研制BVDV新型基因工程疫苗奠定基础。

牛病毒性腹泻—黏膜病病毒C_(24)V株E_0截短基因密码子优化及其在卡介苗中的表达

E0基因编码的蛋白是牛病毒性腹泻—黏膜病病毒(BVDV)的主要保护性抗原之一,其是研制BVDV基因工程疫苗的候选者。E0基因在卡介苗中难以表达,已有研究结果表明E0蛋白具有RNase活性。根据卡介苗密码子使用频率分析E0基因,发现其有多个稀有密码子。通过对该基因截短和密码子优化,在卡介苗中表达E0基因,检测到了E0蛋白的抗原活性,为构建可同时预防结核和牛病毒性腹泻—黏膜病的二价基因工程疫苗奠定基础。

多价荧光抗体监测外源病毒污染的研究

用猪瘟病毒（ＨＣＶ）、猪细小病毒（ＰＰＶ）、牛病毒性腹泻／粘膜病病毒（ＢＶＤ／ＭＤＶ）、伪狂犬病病毒（ＰｒＶ）、兰舌病病毒（ＢｔＶ）、羊口疮病毒（ＯＶ）等六种病毒，多次同时或先后强化免疫猪，制取六价高免血清；用狂犬病病毒（ＲＶ）免疫兔，制取ＲＶ单价高免血清。分别用异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记制成荧光抗体（ＦＡ）。并按二者最佳染色价配制成七价（多价）ＦＡ。由于各病毒在其宿主细胞中复制部位和与宿主细胞相互关系各不相同，在荧光显微镜下，多价ＦＡ对其相应病毒的细胞培养物，能显示出各不相同的荧光特点，而得以检测、鉴定。用相应的多、单价高免血清作抑制染色试验，结果各病毒荧光可被一一抑制，表明了多价ＦＡ具有高度的特异性。对各病毒进行ＦＡ细胞培养物半数感染量（ＦＡ－ＴＣＩＤ５０）与常规ＴＣＩＤ５０或ＬＤ５０测定比较试验，结果前者均高于后者，表明了这种荧光抗体制剂同时具有高度的敏感性。应用多价ＦＡ，对非禽源细胞苗生产中外源病毒的污染进行了中间监测，选用了与强毒荧光无区别的７种感染的细胞作阳性参照，保证了生产单位在使用中的安全，对Ａ、Ｂ二厂生产猪瘟苗有干扰的细胞，进行抽样监测８０批，结果１３批污染ＢＶＤＶ（１６．２５％），１?

奶牛黏膜病的BVDV HJ-1株全基因组序列分析

BVDV HJ-1分离株属于1b基因亚型是引起奶牛发生黏膜病和出血综合症病原,导致高病死率。为了解BVDV HJ-1株的遗传学特征,研究应用PCR方法分13段扩增其全基因组序列,通过克隆测序最终组装出全序列。应用生物信息学软件对BVDV HJ-1基因序列同源性、跨膜结构域、糖基化位点、5’UTR一级结构与二级结构的差异等进行分析。结果测得该毒株全序列为12282 nt,与参考毒株相比存在高度变异,序列同源性在70.1%~93.5%,尤其是非结构蛋白NS4A、NS4B和NS5A同源性在49.0%~93.0%。E1-E2存在5个潜在的跨膜信号区,结构蛋白上富含14个潜在的糖基化位点,5’UTR Ⅰ区和Ⅲb-Ⅲe区相对保守,不同毒株之间II区的二级结构变异大。总之,BVDV HJ-1株全基因组序列信息丰富了我国BVDV的遗传学数据资源,为下一步疫苗的研制和致病机理的研究奠定了基础。

牛病毒性腹泻-黏膜病的诊断与防治

牛病毒性腹泻-黏膜病是由牛病毒性腹泻病毒引起的一种复杂、呈多种临床类型的疾病。临床上以发热、黏膜溃疡糜烂、白细胞减少、腹泻、怀孕母牛流产或产畸型胎儿为主要特征。根据发病情况、临床特征、剖检变化、实验室诊断等情况,对牛病毒性腹泻病毒感染的病例进行了诊断,采取了相应的防治措施,取得了较好的效果。

LPS增强牛病毒性腹泻病毒抗原免疫效果的实验研究

目的:探讨细菌脂多糖(LPS)作为佐剂对牛病毒性腹泻病毒抗原(BVDV)免疫效果的影响.方法:将健康家兔20只随机分5组,分别给予LPS+BVDV、BVDV、福氏佐剂+BVDV、LPS+福氏佐剂+BVDV,以生理盐水作对照,经皮下等免疫2次,ELISA法检测血清抗-BVDV抗体滴度,分别比较各组产生抗-BVDV抗体的差异,并观察各组抗-BVDV抗体的动态变化.结果:LPS+BVDV组、福氏佐剂+BVDV组、LPS+福氏佐剂+BVDV组,其抗-BVDV总抗体滴度都较单独注射BVDV明显增高(P<0.05);LPS+BVDV组与福氏佐剂+BVDV组的抗-BVDV滴度无明显差别,但LPS+福氏佐剂+BVDV组其抗-BVDV抗体滴度要明显高于LPS+BVDV组与福氏佐剂+BVDV组(P<0.05).各实验组抗-BVDVIgG滴度在免疫后第7周左右达到高峰,在观测期内LPS+福氏佐剂+BVDV组IgG抗体滴度在IgG抗体高峰时段均明显高于LPS+BVDV组与福氏佐剂+BVDV组(P<O.05),且抗体达到高峰后持续时间长.结论:在诱导家兔抗-BVDV抗体产生方面,LPS与福氏佐剂具有相似的佐剂效应,且与福氏佐剂具有协同效应.提示LPS有增强家兔抗BVDV免疫效果的作用,与福氏佐剂合用可显著提高家兔抗-BVDV抗体的产生,且可延长抗体的维持时间.

牛病毒性腹泻-粘膜病的检测技术研究进展

对牛病毒性腹泻-粘膜病的病毒分离、琼脂扩散试验、微量中和试验、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验、核酸杂交技术、聚合酶链反应等检测技术进行了综述,对7种技术运用于牛病毒性腹泻-粘膜病的检测作了简要介绍,为进一步研究牛病毒性腹泻病毒提供参考。

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒分离鉴定及生物学特性研究

为分离鉴定新疆地区牛病毒性腹泻—黏膜病病毒（BVDV）流行毒株,掌握该毒株的生物学特性,本试验在新疆北疆部分地区采集牛病毒性腹泻—黏膜病（BVD/MD）疑似病例的粪便,通过RT-PCR检测、细胞分离培养、间接免疫荧光抗体检测、免疫电镜观察及血清中和试验5种方法对毒株进行分离和鉴定。对毒株的TCID50测定后,再对毒株分别进行乙醚敏感性试验、氯仿敏感性试验、胰蛋白酶敏感性试验、酸碱度敏感性试验、温度敏感性试验及核酸分型试验等理化特性检测。经RT-PCR诊断,病料在286bp处出现了目的片段。将RT-PCR诊断为阳性的粪便,接种于密度约为80%的单层MDBK细胞出现了细胞病变,盲传5代至出现典型的细胞病变。将F5代细胞培养物采用间接免疫荧光抗体检测,结果产生了与C24V标准毒株相同的特异性黄绿色荧光。免疫电镜观察到了大量呈球形的BVDV粒子,大小20-40nm。血清中和试验中抗体阳性血清处理组细胞均未出现细胞病变,病毒完全被抗体阳性血清中和。综合以上方法确定分离株为BVDV毒株。对分离株进行毒价和理化特性测定,该毒株TCID50为10-4.5/0.1mL,对乙醚和氯仿敏感,对胰蛋白酶敏感,耐碱不耐酸,对温度敏感,经54℃1h完全被灭活,属于RNA病毒。本试验成功分离到一株新疆BVDV流行毒株,掌握了该毒株的生物学特性,为今后该病的诊断和防控奠定了基础。

牛病毒性腹泻-黏膜病的研究进展

牛病毒性腹泻-黏膜病(BVD-MD)发病率高,具有一定的致死率,且存在持续感染、免疫抑制的情况,对养牛产业造成了较大的危害。BVD-MD的主要临床症状表现为腹泻、高热、黏膜溃疡,消化道呈线性病变。目前国内外已有关于BVD-MD的研究,但临床中确诊此病还需进行更加精准的诊断。文章对BVD-MD的生物学特征、国内外流行情况、临床类型、诊断方式以及该病的防治方法进行阐述,为BVD-MD的相关研究与临床诊疗提供一定参考。

鉴别感染羊驼4种病毒多重PCR检测方法的建立

为了建立一种用于羊驼易感的羊口疮病毒(ORFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV-1)、口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)鉴别的多重PCR检测方法,根据GenBank中公布的ORFV、BVDV-1、FMDV和BTV参考株基因序列分别设计特异性引物,优化引物、dNTP、Taq DNA聚合酶浓度及退火温度,通过敏感性和重复性检验,并对60份羊驼粪便样品和35份羊驼咽拭子样品进行验证。结果显示,所建立的多重PCR方法能够有效区分ORFV、BVDV-1、FMDV和BTV,最低检测限分别为3.18×10^(4)copies/μL、3.13×10^(1)copies/μL、3.06×10^(1)copies/μL、2.95×10^(2)copies/μL。结论:所建立的多重PCR方法能够同时快速鉴别羊驼感染的ORFV、BVDV-1、FMDV和BTV,具有较高的应用价值。

牛病毒性腹泻病毒CC13B株全基因组序列及分析

从长春地区某牛场发生疑似为牛病毒性腹泻-黏膜病的病牛粪样中分离到1株病毒,经序列测定为牛病毒性腹泻病毒命名为BVDV CC13B株。核苷酸序列的测定结果显示,CC13B毒株的完全基因组序列由12 265个核苷酸组成,其中5′端非编码区包含380个核苷酸,3′端非编码区包含188个核苷酸。病毒基因组含有1个大的读码框架,编码1个由3 898个氨基酸组成的前体多聚蛋白。序列对比结果显示,CC13B毒株的核苷酸和氨基酸序列与国外CP-5A毒株同源性最高,分别为为96.2%和97.3%;而与国内分离株JZ05-1的同源性最低,分别为69.8%和71.0%。系统进化树分析结果表明,CC13B毒株与国内分离的长春184、Xinjiang-3156和H等分离株归类为BVDV基因Ⅰ型的Ib基因亚型。结果表明,长春地区近年发生的牛病毒性腹泻-黏膜病依然主要由BVDV基因Ⅰ型毒株引起。