吡柔比星与c-myc G4-DNA相互作用的研究

目的研究吡柔比星与c-mycG4-DNA的相互作用．并探讨其可能的抗肿瘤作用机制。方法采用紫外可见吸收光谱、圆二色光谱（CD）、等温滴定微量量热试验（ITC）、核磁NMR滴定以及荧光能量共振转移（FRET）熔点试验等方法，研究吡柔比星与c-mycG4-DNA的相互作用；采用PCR-Stop方法研究吡柔比星对c-mycG4-DNA复制的抑制。结果在电子吸收光谱中，吡柔比星的特征吸收峰随c-mycG4-DNA浓度的增加出现明显的减色效应和红移，减色率AH=9．2％（△λ=4nm）；根据热力学计算的结合常数K11为1．0×10^4μmol／L；随着吡柔比星的加入pmycG4-DNA的圆二色光谱在265nrn处的信号变化均匀缓慢，在300nm处出现1个负的诱导信号：在吡柔比星作用下，c-mycG4-DNA5＇-末端表面碱基G21-A25发生明显变化，并且熔点升高20．2℃；PCR-Stop试验证实，随着吡柔比星浓度的增加，c-mycG4一DNA的复制能力不断减弱。结论吡柔比星能够以沟槽方式与c-mycG4-DNA相互作用，稳定c-mycG4-DNA四链体结构，并抑制其复制功能．吡柔比星抗肿瘤活性可能与它能够结合并稳定c-mycG4-DNA密切相关。

大黄素与c-myc G4-DNA相互作用的研究

目的研究大黄素与c-myc G4-DNA的相互作用,并探讨其抗肿瘤作用机制。方法采用紫外可见吸收光谱、荧光光谱、圆二色光谱和热变性试验等方法,研究大黄素与c-myc G4-DNA的相互作用,采用PCR-Stop试验研究大黄素对c-myc G4-DNA复制的抑制作用。结果电子吸收光谱中,大黄素在400～500 nm之间的特征吸收峰,随c-myc G4-DNA浓度的增加出现明显的减色效应和红移,减色率ΔH=51.6%(Δλ=3 nm);随着大黄素的加入,c-myc G4-DNA的圆二色光谱在295 nm出现1个正的诱导信号;c-myc G4-DNA的熔点在大黄素作用下升高3.5℃;PCR-Stop试验证实,随着大黄素浓度的增大,c-myc G4-DNA的复制能力不断减弱。结论大黄素能够以沟槽方式与c-myc G4-DNA相互作用,稳定c-myc G4-DNA四链体结构,并抑制其复制功能。

血根碱与c-mycG4-DNA相互作用的光谱法研究

目的研究血根碱与c-myc G4-DNA的相互作用。方法采用紫外可见吸收光谱、圆二色谱、变温试验等方法,对血根碱与c-myc G4-DNA的结合常数、结合比例、结合模式及稳定性进行研究。结果在紫外可见吸收光谱中,血根碱在300-350 nm之间的特征吸收峰随c-myc G4-DNA浓度的增加出现明显的减色效应和红移,减色率ΔH=35.4%（Δλ=7 nm）,与c-myc G4-DNA结合常数为3.1×10^4mol/L;G-四链体/血红素过氧化物酶竞争试验中,血根碱竞争血红素引起吸光度下降;变温试验中c-myc G4-DNA的熔点在血根碱作用下升高4.7℃。结论血根碱以结合比例为1∶1外部堆积于c-myc G4-DNA,并促使其结构稳定,这可能是血根碱抗肿瘤的分子机制之一。

靶向肿瘤因子c-MYC基因启动区G4-DNA的小分子药物设计及核磁共振研究进展

肿瘤基因MYC在人类70%癌细胞中高表达,抑制其转录是治疗肿瘤的有效手段.c-MYC启动子区P1近端的核酸酶超敏元件III1(NHE III1)控制MYC基因近90%的转录激活.NHE III1区域富含碱基G序列并且形成G-四链体(G4),调控c-MYC基因转录,是抗肿瘤药物靶标.但G4-DNA和G4-RNA的三维结构高度相似,小分子与其他G4(如端粒G4、mRNA G4、c-Kit G4等)的非特异性作用会产生小分子药物“脱靶”效应,同时小分子药物会诱导其他G4形成从而干扰正常细胞的功能,造成靶向c-MYC G4抗癌药物设计困难.本文综述了近些年靶向肿瘤因子c-MYC G4-DNA的小分子药物研究进展,及核磁共振(NMR)技术在G4-DNA和G4-RNA结构确定中的作用,为靶向c-MYC G4-DNA的小分子药物设计等相关研究工作提供参考.

微波辅助四(p-甲氧苯基)卟啉铜(Ⅱ)的合成及其与c-myc G4 DNA的相互作用

以吡咯、p-甲氧基苯甲醛为原料,丙酸为溶剂,130℃条件下制得四(p-甲氧苯基)卟啉(TMOPP);然后在100℃微波辐射条件下,以TMOPP和乙酸铜为原料,DMF为溶剂,制得目标化合物四(p-甲氧苯基)卟啉铜(Ⅱ)配合物(CuTMOPP)。采用电喷雾质谱、紫外光谱和红外光谱等分析方法对所合成的目标化合物进行了表征,目标化合物的理论值和实验值基本一致。进一步采用紫外光谱、CD光谱、FRET熔点实验、PCRStop实验考察了目标化合物与c-myc G4DNA的相互作用,结果表明目标化合物可能与c-myc G4DNA以静电方式结合,从而抑制其复制,进一步对其生物功能的影响还在研究中。

色胺酮Zn(Ⅱ)配合物的合成、晶体结构及与G4-DNA作用研究

色胺酮是一种天然吲哚喹唑啉生物碱,具有抗微生物、抗肿瘤和抗炎活性。以色胺酮(Try)为配体,溶剂热法合成色胺酮Zn(Ⅱ)配合物,通过X-射线单晶衍射分析,确定了金属配合物的晶体结构。光谱法研究及琼脂糖凝胶电泳实验表明,色胺酮及其Zn(Ⅱ)配合物均表现出较强的稳定G-四链体H21T-DNA作用,结合常数Kb>107,而且对p BR322质粒DNA也表现出较强的切割作用,色胺酮锌(Ⅱ)配合物的切割作用强于配体色胺酮。研究结果为进一步筛选色胺酮及其配合物的抗肿瘤活性以及探讨生物碱与G4-DNA的稳定作用构效关系及设计生物碱抗肿瘤药物提供了参考。

抗芽殖酵母端粒G4-DNA结构的单克隆抗体和基因工程单链抗体片段的制备和定性研究

大多数真核生物端粒3'末端由富含鸟苷酸的重复序列组成,并可以在体外形成四链G4- DNA结构。为了解这种结构是否在体内存在,本文中我们以芽殖酵母作为研究对象,将G4-DNA作为抗原免疫BALB／c小鼠,制备抗G4-DNA的单克隆抗体,结果显示该抗体能够特异性识别富含鸟苷酸重复序列DNA。为了提高抗体的特异性,我们通过基因工程制备抗体:利用RT-PCR的方法,得到抗体重链和轻链可变区的基因,然后克隆到载体pET22b中得到表达质粒pET22b-scFv,转入大肠杆菌进行表达。在细胞周质中我们检测并纯化到了目的基因的表达产物。另外,我们还利用该基因序列进行了初步的结构分析。基因工程抗体在大肠杆菌中的成功表达及结构分析为今后利用该抗体进行定点突变来研制高特异性和亲和力的抗G4-DNA抗体奠定了基础。

丙型肝炎病毒NS4B对肝细胞c-myc和ras蛋白表达的影响

目的研究丙型肝炎病毒非结构蛋白4B(NS4B)对肝细胞内癌基因c-myc和ras蛋白表达的影响,从而探讨其在肝癌发生机制中的可能作用。方法通过脂质体介导法,将空白载体PXCN2及丙型肝炎病毒NS4B重组质粒PCXN2-NS4B引入Chang肝细胞内,并G418筛选作稳定传代,RT-PCR法鉴定质粒成功转染入肝细胞内,免疫细胞化学方法观察细胞内c-myc和ras表达情况。结果获得具有G418抗性的Chang肝细胞;空白对照组及空白载体组无c-myc表达,转染NS4B组c-myc表达率为(21.3±1.2)%,与空白对照组及空白载体组比较差异有显著性;空白对照组及空白载体组ras弱阳性表达,转染NS4B组ras呈阳性表达,与空白对照组及空白载体组比较差异有显著性。结论丙型肝炎病毒NS4B可促进癌基因c-myc和ras表达,并可能在丙型肝炎病毒的致癌机制中起重要作用。

色胺酮卤代衍生物的合成、抗肿瘤活性及其与G-四链体DNA相互作用研究

色胺酮（Tryptanthrin，Try）是重要的天然吲哚喹唑啉类生物碱，本文首次合成了2，8-二溴色胺酮（Br-Try）及8-碘色胺酮（I-Try），并研究其抗肿瘤活性；以G-四链体DNA为靶点研究其作用机制。化合物与BEL-7404、HepG2、NCI．H460、Tj24等四种肿瘤细胞株的体外抗肿瘤活性和HL-7702正常肝细胞株的毒性实验表明，Br-Try和I-Try表现出比Try的抗肿瘤活性有不同程度的增强，而对正常细胞毒性减弱的结果。Br—Try对BEL-7404、NCI-H460和T-24肿瘤细胞株表现出比Try和顺铂更强的抗肿瘤活性，IC50值在7．08～9．68p．M，而I-Try只对HepG2细胞株表现了比Try和顺铂增强的抑制活性，Ic50值为15．78±0．33μM。初步的作用机制分析表明，三种化合物与G一四链体DNA有较强作用．以Br-Try最强。

咔唑类二聚体衍生物的设计、合成及用于G4-DNA荧光探针的初步研究

目的设计、合成咔唑类二聚体衍生物并进行G4-DNA荧光探针的初步探究。方法分别以化合物3,3-亚甲基双(2,7-二甲氧基-N-9-咔唑乙酸甲酯)和3,6,9,12-四甲氧基-5,11-二氢吲哚[3,2-b]咔唑为起始原料,经过氧化、Knoevenagel缩合以及卤代、付克烷基化、胺解等反应制备得到目标化合物1~9。采用紫外分光光谱法和荧光光谱法在分子水平探究目标化合物与G4-DNA的相互作用,并计算结合比例与结合常数。结果本文合成了9个新型咔唑衍生物,并探究了其中含有氨基侧链的产物与G4-DNA的相互作用。结果表明,目标化合物2与G4-DNA结合的物质的量比为2∶1,其结合常数达到2.31×10^(8)(mol·L^(-1))^(-2)。结论目标化合物2具有成为G4-DNA荧光探针的潜质,有深入探究的价值。

钌配合物稳定端粒DNA的作用及其诱导细胞凋亡分子机制的研究

端粒酶在肿瘤细胞中高表达,已经成为抗肿瘤药物的重要靶点,由于很多肿瘤细胞中富含G4-DNA,通过稳定G-四链体DNA的形成来抑制端粒酶的活性已成为抗癌药物的一个新策略.本文设计了两种钌配合物,调查了这两种钌配合物稳定G4-DNA的能力,发现配合物2稳定端粒G4-DNA的能力强于配合物1,配合物2能够诱导端粒G4-DNA发生构型的转化,而配合物1不能诱导G4-DNA发生构型的转化,这项研究结果证明,钌配合物与G4-DNA的作用能力与配体的平面性有关.在抗肿瘤活性方面,配合物2表现出更强的抗肿瘤活性,尤其是对HepG2细胞具有较强的抑制作用,推测其是以端粒酶为靶点发挥的抗肿瘤作用.配合物2能够诱导肿瘤细胞凋亡,能诱导G1期细胞阻滞和DNA碎片的形成(细胞凋亡的特征).据此推测本论文设计的钌配合物是一个潜在的抗肿瘤药物.