HBV相关分泌蛋白c18orf54的克隆表达及初步功能研究

目的体外原核表达C18ORF54的重组蛋白,对其进行纯化,制备兔抗C18ORF54蛋白多克隆抗体,并对该重组蛋白对HepG2细胞可能的生物学作用进行初步研究。方法应用反转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术,以HepG2细胞总RNA为模板,反转录并扩增c18orf54目的基因片段,构建原核表达载体pET-32a(+)-c18orf54。转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖(isopropylβD thiogalacttpy ranoside,IPTG)诱导并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium lauryl sulfate-polyacrylamide gol electrophoresis,SDS-PAGE)分析、免疫印迹(Western blotting)、生物质谱技术分析证实c18orf54重组蛋白表达正确。用Ni+亲和柱纯化表达蛋白。C18ORF54重组蛋白免疫新西兰兔,获得抗c18orf54蛋白的多克隆抗体。以纯化的C18ORF54蛋白为抗原,分别以免疫前后的新西兰兔血清作为第一抗体,利用Western blotting和酶联免疫吸附(enzyine linked immunosorbent assay,ELISA)法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测。将不同浓度范围的C18ORF54重组蛋白与培养的HepG2细胞共孵育,初步了解该重组蛋白对HepG2细胞可能的生物学作用。结果 PCR法扩增获得c18orf54基因片段,成功表达了C18ORF54重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting分析得到证实。成功获得重组蛋白及抗C18ORF54多克隆抗体。ELISA检测证实多克隆抗体效价>1∶320 000。结论利用大肠埃希菌BL21(DE3)能够成功表达C18ORF54蛋白,获得高特异性、高效价兔抗C18ORF54重组蛋白的多克隆抗体,为今后研究C18ORF54蛋白的生物学特性奠定了基础。