基于表型聚类和CDDP标记的牡丹花瓣色斑遗传多样性分析

【目的】采用色斑表型性状分析和保守DNA序列多态性(conserved DNA-derived polymorphism,CDDP)分子标记技术相结合的方法,揭示牡丹花瓣基部色斑的遗传起源。【方法】利用19个色斑表型性状和CDDP分子标记对191份牡丹材料的花瓣色斑进行遗传多样性分析,利用Origin软件进行表型性状变异分析和系统聚类,采用PopGene 2.4软件计算分子标记多样性指数和多态性位点率等,利用NTSYS软件非加权组平均法(UPGMA)绘制聚类树状图,并进行一致检测和Mantel检测。【结果】牡丹色斑表型变异分析结果表明:牡丹花瓣色斑性状发生了强变异,尤其是色斑颜色变异系数较大。表型性状聚类结果显示,紫斑牡丹与其他种或品种牡丹交集较多,且与西北牡丹品种关系最为密切。利用17条CDDP引物扩增191份牡丹材料的花瓣DNA,共扩增出401条条带,多态性位点率达到96.91%。在色斑群体水平上,有效等位基因数为1.3759,Nei’s基因多样性指数为0.2122,Shannon-Wiener信息指数为0.3324,说明牡丹花瓣色斑在分子水平上具有丰富的遗传多样性。聚类结果显示,紫斑牡丹和卵叶牡丹、四川牡丹聚在一起,三者亲缘关系较近,紫斑牡丹对现有牡丹栽培品种的色斑性状产生了较大影响,可能是牡丹品种色斑的主要来源。将表型性状聚类和CDDP分子标记聚类的遗传矩阵进行Mantel检验,得出相关系数为0.55,表明两种聚类结果有相似之处,均能很好地体现牡丹花瓣色斑的遗传来源。【结论】紫斑牡丹是牡丹品种色斑的主要来源,卵叶牡丹和四川牡丹也对牡丹品种色斑的形成有影响。

菊花品种的遗传多样性分析及CDDP指纹图谱构建

利用来源保守DNA序列多态性（CDDP）标记技术，探讨50个不同花径、瓣型、花色的菊花品种的遗传多样性。筛选的19条CDDP引物，共产生234个条带，平均每条引物产生12．32个条带，其中211个（90．17％）为多态性条带。菊花品种间的SM相似系数变化范围为0．6170～0．9447，平均0．7330。至少需要2条引物组合（WRKY-R2和WRKY-R3）可以完全区分50个品种。UPGMA聚类结果表明，所选的菊花品种基本按花径聚类，与瓣型和花色无直接关系。研究表明CDDP技术可有效用于菊花遗传多样性分析和品种鉴定研究。

大豆CDDP分子标记技术体系的优化、验证及引物筛选

CDDP分子标记是一种新型目的基因分子标记技术。采用L16(45)正交试验设计对影响大豆CDDP-PCR反应的Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度、dNTPs浓度和模板DNA用量等因素进行优化。优化后的大豆CDDP-PCR体系为:Mg2+浓度2.0 mmol.L-1、Taq聚合酶用量1.5 U、引物浓度0.375μmol.L-1、dNTPs浓度0.3 mmol.L-1、DNA模板用量40 ng。该反应体系在16个大豆品种的验证中表现稳定可靠。利用大豆品种吉育75、本地黑豆及其9株F2代对该反应体系进行了初步的遗传验证,结果显示,杂交后代植株中出现了双亲的位点及亲本位点的缺失。并从21条引物中筛选出条带清晰、多态性较好的13条引物。该反应体系的建立为大豆种质遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建及分子标记辅助育种奠定了基础。

miRNA765高表达对胃癌耐药细胞株BGC-823/CDDP耐药性的影响

目的观察miRNA765高表达对胃癌顺铂(CDDP)耐药细胞株BGC-823/CDDP耐药性的影响。方法将PCR扩增的包含miRNA765前体的基因序列克隆至真核表达载体,构建miRNA重组表达载体;阳离子脂质体转染重组质粒到BGC-823/CDDP细胞。转染后48 h,Real-Time PCR和Western blotting法分别检测细胞中miRNA765和细胞因子诱导的凋亡抑制因子1(CIAPIN1)蛋白的相对表达量;采用不同浓度CDDP处理转染后48 h的BGC-823/CDDP细胞,24和48 h后MTT法检测细胞活性并计算细胞对于CDDP的半抑制浓度(IC50)。采用终质量浓度为1μg/mL的CDDP处理基因干预后的BGC-823/CDDP细胞,双染法检测细胞凋亡率。结果 BGC-823/CDDP细胞内miRNA765的相对表达量明显低于其亲本细胞BGC-823,CIAPIN1蛋白相对表达量则明显高于其亲本细胞株(均P<0.01)。在BGC-823/CDDP细胞内高表达miRNA765可明显抑制CIAPIN1蛋白的表达,转染后48 h的CIAPIN1蛋白表达量明显低于未转染组(P<0.01);miRNA765高表达可明显降低BGC-823/CDDP细胞的耐药能力,48 h后IC50值从(18.27±3.92)μg/mL降至(1.50±0.43)μg/mL(P<0.05)。转染48 h后,BGC-823/CDDP细胞的凋亡率从(10.1±1.7)%上升至(53.4±7.9)%(P<0.01)。结论 miRNA765高表达可以明显降低胃癌耐药细胞株BGC-823/CDDP的耐药能力。

利用CDDP标记的菏泽牡丹品种资源的遗传多样性

【目的】在品种群水平和花色群体水平上分析菏泽牡丹资源的遗传多样性和遗传分化,为该资源的保护和利用提供理论依据与技术支持。【方法】利用CDDP分子标记技术,对白、粉、黑、红、黄、蓝、绿、紫红、紫和复色系等10个花色群体构成的299份菏泽牡丹品种资源的基因组DNA进行扩增分析。【结果】用18条CDDP引物对10个花色群体共299份样品进行扩增,共检测到385条扩增带,其中多态性条带368条,特异条带23条,分别占总条带的95.58%和5.97%。在品种群水平上,Nei’s基因多样性指数、有效等位基因数和Shannon信息指数分别为0.1648、1.2569和0.2695;在花色群体水平上,上述指标依次为0.1451、1.2313和0.2306。综合分析各项指标得出,红色系和紫色系具有较高的遗传多样性,复色系和绿色系牡丹的遗传多样性较低。花色群体间的遗传距离较近,平均为0.0271;遗传一致度较高,平均为0.9735;遗传分化系数为0.1252,表明只有12.52%的遗传分化存在于群体间;群体间还具有较大基因流值(3.4939)。遗传多样性分析和UPGMA聚类结果在分子水平上验证了牡丹品种资源的花色演化趋势:以粉色系和红色系为中心,渐渐演化出紫红、紫、蓝和白色系,再进化为黄色系和黑色系,绿色系和复色系属于退化的色系。【结论】CDDP技术可有效揭示牡丹种质资源的遗传多样性。在品种群水平上,菏泽牡丹品种资源遗传多样性高于花色群体水平。花色群体间存在一定程度的遗传分化。聚类结果揭示了牡丹花色的演化趋势。

5-Aza-CdR与低浓度CDDP联合用药对胃癌细胞系生长及DAPK1的影响

目的研究5-Aza-CdR与低浓度CDDP联合用药对胃癌细胞系生长及DAPK1的影响。方法选择CDDP(1×10-6 mol/L)与1×10-6 mol/L的5-Aza-CdR分别处理体外培养的BGC823细胞与SCG7901细胞,5-Aza-CdR与CDDP联合处理体外培养的细胞后,用MTT法检测药物处理后的细胞增殖活性;RT-PCR法检测用药前后细胞中DAPK1的mRNA表达的变化。结果与单独用药组比较,胃癌细胞在药物联合作用组生长增殖活性明显被抑制。联合用药组DAPK-1基因的mRNA表达明显增加。结论 5-Aza-CdR与CDDP联用对胃癌细胞的生长抑制具有协同作用。

CIK细胞联合顺铂对卵巢癌耐药细胞SKOV3/CDDP的杀伤作用

目的:探讨细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer,CIK)细胞联合顺铂对卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/CD-DP小鼠腹腔移植模型的体内外杀伤作用。方法:取正常人的外周血单个核细胞(PBMC),加入IFN-γ、IL-2、CD3McAb和IL-1,体外诱导成CIK细胞。用MTT法测定CIK细胞、顺铂及两者联合对人卵巢癌细胞株SKOV3/CDDP细胞的杀伤活性。在SCID小鼠腹腔内接种卵巢癌SKOV3/CDDP细胞,观察CIK细胞对荷瘤鼠的体内抑瘤作用,并用RIA法检测各组血清中CA125的含量。结果:顺铂对SKOV3/CDDP细胞的IC50为315.5μg/ml,较其对SKOV3细胞的IC50(85μg/ml)增加了4倍;CIK细胞对SKOV3与SKOV3/CDDP细胞的杀伤活性均在48h最高,且随效靶比的增高而增强,其对SKOV3/CDDP细胞的杀伤活性明显高于SKOV3(P<0.05)。仅25μg/ml的顺铂即可使效靶比为12.5∶1组中的联合杀伤率比单纯顺铂组增加5.8倍,比单纯加CIK(相同效靶比)细胞杀伤率增加2.3倍,且随效靶细胞比值和顺铂浓度的升高呈依赖性增加。与对照组相比,CIK组与CIK+顺铂组均能显著抑制癌性结节的生长,抑瘤率达100%,且3组SCID鼠血中CA125值有显著性差异(P<0.05)。结论:正常人CIK细胞联合顺铂对清除晚期卵巢癌表达耐药蛋白的腹腔种植转移病灶可能会有较好的效果,并有希望成为前景良好的综合治疗方案。

人肺腺癌耐药细胞株A549/CDDP中相关泛素化蛋白质研究

目的研究肺腺癌中与耐药相关的泛素化或类泛素化蛋白质及其与耐药的关系。方法从经顺铂处理和未处理的A549细胞及其耐顺铂细胞株中分离泛素化、类泛素化蛋白质,通过1D SDS-PAGE和Chip HPLC-MS/MS分析鉴别蛋白,Western blot法验证质谱结果;MTT法检测细胞对顺铂的耐药性。结果鉴定出发生类泛素化修饰蛋白质-PKM2,并发现其在耐药细胞株中低表达;以蛋白酶体抑制剂MG132干预细胞后,PKM2表达上调;CDDP和MG132联合作用细胞后,细胞耐药性下降。结论细胞中PKM2表达水平与肿瘤细胞耐药程度呈负相关,PKM2受蛋白质类泛素化修饰-SUMO化修饰调节,提示PKM2可能与肿瘤耐药的发生密切相关。

芒果CDDP分子标记正交优化设计及引物筛选

以芒果基因组DNA为模板,选择正交设计试验对控制DNA保守序列多态性——聚合酶链式反应(CDDP-PCR)的4个因素(模板DNA浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Mg^(2+)DNA聚合酶用量)进行正交试验,构建了较佳的芒果CDDP-PCR反应体系,含0.50 U Mg2+DNA聚合酶、0.40 mmol·L^(-1)d NTPs、1.00μmol·L^(-1)引物、0.50 ng·μL^(-1)模板DNA,加双蒸水使得总体积达20.00μL.对比四因子对PCR反应的影响,影响最强的因素是含Mg2+的DNA聚合酶,影响最弱的因素是模板DNA.利用供试的20个芒果品种验证了该体系的稳定性和可行性,21条CDDP引物均可扩增出明晰整齐的条带.

托瑞米芬逆转肺癌耐药细胞株A549/cDDP耐药性的研究

目的:探讨托瑞米芬(TOR)对耐顺铂(cDDP)细胞株A549的逆转作用,为临床应用提供实验数据。方法:用不同浓度的托瑞米芬单独及与cDDP联合与耐药细胞A549共同培养,通过MTT法和流式细胞仪法检测其对A549/cDDP的逆转及增敏效果。结果:经不同浓度的托瑞米芬单独及与cDDP联合与耐药细胞A549共同培养后,单独TOR(5μmol/L、10μmol/L)对A549/cDDP细胞的增殖均无明显影响,各组间数据无明显差异(P>0.05)。当cDDP与TOR联合作用时无论TOR终浓度5μmol/L或10μmol/L,均能明显增加cDDP对A549/cDDP细胞的敏感性(P<0.05,P<0.001)。其IC50值分别为39.06μmol/L和30.64μmol/L,逆转倍数分别为2.05倍和2.65倍。cDDP+TOR终浓度5μmol/L与cDDP+TOR终浓度10μmol/L之间除了在cDDP浓度为200μmol/L时两者有差异(P<0.05)外其它均无明显差异。结论:托瑞米芬与DDP联合应用可以提高A549/cDDP的逆转及治疗效果。

沉默GST-π基因表达对EC9706/cDDP细胞顺铂耐药性的影响

目的:观察沉默谷胱甘肽S转移酶-π(GST-π)基因的表达对食管鳞状细胞癌顺铂耐药细胞系EC9706/cDDP细胞耐药性的影响。方法:构建靶向GST-π基因的siRNA重组慢病毒GSTsi1、GSTsi2和无义对照GSTsiC,转染EC9706/cDDP细胞。通过RT-PCR及Western blot法检测GSTsi1、GSTsi2和GSTsiC感染前后EC9706/cDDP细胞中GST-πmRNA和蛋白的表达;MTT法检测感染GSTsi2、GSTsiC与未感染的EC9706/cDDP细胞对顺铂敏感性的变化。结果:感染GSTsi1、GSTsi2后EC9706/cDDP细胞GST-πmRNA的表达下调(F=3.490,P<0.001),其蛋白表达也减弱。感染GSTsi2的EC9706/cDDP细胞对顺铂的耐药指数较感染GSTsiC和未感染的EC9706/cDDP细胞降低(F=50.510,P<0.001)。结论:沉默GST-π基因的表达可降低EC9706/cDDP细胞的顺铂耐药性。

肺癌细胞株中GEM和CDDP药物敏感性相关基因的研究

背景与目的筛选小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞株中与健择(gemcitabine hydrochloride,GEM)和顺铂(cisplatin,CDDP)药物敏感性相关的基因,有助于进一步阐明抗癌药物作用机制,为克服抗癌药物的耐药性、研制开发新的抗癌药物提供新线索,同时也将为临床的个体化治疗提供理论依据。方法采用MTT比色分析法测定4株SCLC细胞株和6株NSCLC细胞株对CDDP和GEM的药物敏感性,同时应用cDNA macroarray技术检测10株肺癌细胞株中1291个药物敏感性相关基因的表达状态,分析二者之间的相关性。结果与GEM药物敏感性呈明显正相关(r≥0.632,P<0.05)的基因有6个;与CDDP药物敏感性关联的基因共有45个;与GEM、CDDP敏感性关联(r≥±0.4)的基因有41个;肺癌细胞系中与GEM和CDDP两类药物敏感性呈明显相关的基因是Metallothinein(信号转导分子)、CathepsinB(组织蛋白酶B)和TIMP1(生长因子);肺癌细胞系中与GEM、CDDP药物敏感性相关联的基因主要分布于Metallothinein、Cathepsin B、生长因子TIMP1等类别。结论SCLC和NSCLC细胞株中GEM、CDDP存在药物敏感性相关基因,其中Metallothinein、Cathepsin B和TIMP1基因与GEM药物敏感性呈正相关,与CDDP药物敏感性呈负相关。

杧果品种亲缘关系的CDDP分析

利用保守DNA衍生多态性(CDDP)分子标记技术,对广西亚热带作物研究所保存的31个杧果品种进行遗传多样性分析,为杧果种质资源的鉴定及分子辅助育种提供理论依据。筛选出8条CDDP引物对供试的杧果品种进行PCR扩增,分析电泳图,并进行聚类分析和主成分分析。从31个杧果品种中共扩增出107条清晰条带,其中多态性条带(NPB)100条,多态性比率(PPB)达到93.57%。平均每条引物可扩增出13条带和12条多态性带。每个位点的平均等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei's基因多样性(H)、Shannon信息指数(I)分别为1.8471、1.6368、0.4108、0.84,表明杧果品种间具有丰富的遗传多样性。供试杧果品种间相似性系数范围为0.6206~0.9208。UPGMA聚类结果表明,在遗传相似系数0.6906处可以将供试杧果划分为7类,主成分分析结果与聚类分析结果基本一致,划分结果与杧果来源地无密切关系。筛选获得的CDDP引物对杧果种质资源有较高的多态性检测率,适用于资源鉴别及亲缘关系分析。

甜菜CDDP-PCR扩增体系的建立及优化

为了建立最优甜菜的来源保守DNA序列多态(conserved DNA-derived polymorphism,CDDP)分子标记扩增体系,以期利用CDDP分子标记技术进行甜菜品种指纹图谱的构建、核心种质构建及分子标记辅助育种。本实验利用单因素变量的方法对甜菜CDDP体系进行优化;最终确定了甜菜最适CDDP体系,体系总体积为20μL,其中包括10μL MIX,0.5μL引物,0.5μL DNA模板。利用优化的体系对8个甜菜二倍体品系进行扩增,结果表明所有材料都能扩增出清晰稳定的条带,并且多态性丰富,由此可以说明本研究对CDDP进行优化的体系非常适合甜菜CDDP-PCR分析。

人肺腺癌耐顺铂细胞A549/CDDP获得侵袭转移能力的分子机制

目的:研究人肺腺癌耐顺铂细胞A549/CDDP获得侵袭转移能力的分子机制。方法:细胞划痕实验和Transwell侵袭实验比较A549和A549/CDDP的转移侵袭能力的差别,以及LY294002对A549/CDDP侵袭转移能力的影响。蛋白质免疫印迹技术检测AKT,NF-κB,STAT3信号通路的激活情况,MTT法检测A549和A549/CDDP对顺铂的敏感性,以及PI3K/AKT通路抑制剂LY294002对A549/CDDP细胞对顺铂的敏感性的影响。结果:A549/CDDP对顺铂的耐药性以及侵袭转移能力相对于A549有明显增强。Western blot结果表明:A549/CDDP细胞AKT通路被激活,NF-κB,STAT3通路没有明显变化。LY294002能够明显抑制A549/CDDP的侵袭转移能力并且能够提高A549/CDDP对于顺铂的敏感性。结论:A549/CDDP细胞相对于A549细胞的侵袭转移能力明显增强,其机制与PI3K/AKT信号通路的激活有关。

miR-129-1-3p通过靶向抑制WEE1蛋白激酶表达逆转HNE1/CDDP人鼻咽癌细胞顺铂耐药

目的探讨miR-129-1-3p对人鼻咽癌耐药细胞HNE1/顺铂(CDDP)敏感性的影响及相关作用机制。方法培养人鼻咽癌HNE1细胞及耐CDDP的HNE1/CDDP细胞,噻唑蓝(MTT)法检测HNE1/CDDP细胞对于CDDP的耐药指数;采用反转录PCR检测miR-129-1-3p和WEE1蛋白激酶在两种细胞的表达水平。采用脂质体法将miR-129-1-3p模拟物(miR-129-1-3p mimics)和阴性对照RNA(miR-NC)转染HNE1/CDDP细胞,并设立对照组。MTT法检测转染后HNE1/CDDP细胞对CDDP的半数抑制浓度(IC50)变化,Western blot法检测转染后各组细胞WEE1蛋白水平,双荧光素酶实验评价miR-129-1-3p对WEE1的靶向调控作用。结果HNE1/CDDP细胞对于CDDP的耐药指数为5.29。HNE1细胞中的miR-129-1-3p水平高于耐CDDP的HNE1/CDDP细胞,WEE1 mRNA水平低于耐CDDP的HNE1/CDDP细胞,miR-129-1-3p水平与WEE1 mRNA水平呈负相关(r=-0.9784)。与其余两组相比,miR-129-1-3p mimics转染后,HNE1/CDDP细胞对CDDP的IC50明显降低,WEE1的蛋白水平也明显降低。双荧光素酶实验结果显示miR-129-1-3p靶向调控WEE1的3'非翻译区(3'-UTR)。结论miR-129-1-3p通过靶向抑制WEE1表达逆转HNE1/CDDP鼻咽癌细胞CDDP耐药。

牡丹CDDP分子标记引物筛选及多态性分析

验证了牡丹CDDP反应体系的稳定性和重复性。在21条CDDP引物中筛选出了20条多态性引物,其中18条对牡丹品种具有较强的鉴别能力。用20条CDDP多态性引物对22个国内外牡丹品种进行PCR扩增,每条引物的扩增条带从3～25条不等,共获得297条DNA片段,其中多态性片段276条,多态性比率为92.93%,平均每条引物扩增出14.85种多态性基因型。多态性好的18条引物对22份牡丹材料的位点多态性信息量分布在0.8379～0.9597之间,平均达0.9124。可以运用CDDP分子标记技术对牡丹种质资源进行遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建、基因定位等研究。