肠道病毒71型重组VP2蛋白原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP2蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71 VP2基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体形成pET32a(+)/VP2,转化BL21(DE3),IPTG诱导表达,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步分析蛋白表达产物,利用Ni+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经Western blot初步验证其抗原性。结果成功构建pET32a(+)/VP2重组质粒,经大肠杆菌表达,纯化获得相对分子质量约为48000的融合蛋白,经Western blot证实其抗原性良好。结论表达并鉴定了VP2抗原,为EV71疫苗研制及检测试剂盒的研发奠定了基础。

细小病毒B19壳抗原VP2在大肠杆菌中的表达及血清学检测

为了进行B19感染临床的血清学诊断,利用原核表达载体PQE31克隆和表达B19壳蛋白VP2,酶切鉴定PCR产物及PQE31-VP2克隆的正确性,Western-blot证明表达蛋白的特异性,并对其表达条件和纯化条件进行了优选。在D600为0.7,诱导时间为5h时表达量最高。Ni2+亲和色谱,用0.5mol/L咪唑洗脱液洗脱,获得纯化蛋白。利用纯化蛋白检测100份人群血清,免疫斑点法结果为阳性94例,阴性6例;ELISA结果为阳性84例,阴性16例,两种方法结果一致(0.25>P>0.1)。

北京地区人Boca病毒外壳蛋白VP2的原核表达及抗原性初步分析

目的获得新发现的北京地区人Boca病毒（HBoV）主要外壳蛋白VP2，为对该病毒病原学的深入研究打下基础。方法从已证明为HBoV阳性的临床标本BJ3722中经PCR扩增得到HBoV VP2蛋白编码区基因片段，将其克隆至pUCm-T载体中，然后再亚克隆至原核表达载体pET-30b（＋），经双酶切、PCR、序列测定等方法挑选、鉴定阳性克隆，得到重组表达质粒pET-30b-VP2，转化大肠杆菌B121（DE3），在不同的温度下利用IPTG诱导蛋白表达；对得到的蛋白表达产物粗提物经NP亲和层析纯化后，利用抗组氨酸抗体、兔抗HBoV-VP2多肽免疫血清及人血清进行抗原性初步分析。结果BJ3722 VP2基因正确插入pET-30b中，开放阅读框架正确，表明得到了预期的pET-30b-VP2重组原核表达质粒。比较25℃、30℃、37℃ 3个不同温度下的蛋白表达产物，以25℃ 1mmol／L IPTG诱导培养过夜后产生的带6×His标记的重组VP2蛋白量最大，主要以包涵体形式存在。VP2蛋白粗提物经NP亲和层析，在pH4．5时获得较理想的纯化结果。Western blot显示所表达的蛋白质能够与抗组氨酸特异性抗体、兔抗HBoV-VP2蛋白多肽免疫血清以及人血清发生反应。结论本研究成功构建了重组pET-30b-VP2原核表达质粒，改善了表达及纯化条件，得到了较大量的HBoV-VP2蛋白表达，并初步证明表达产物具有抗原特异性，可用于对这一新发现病毒的进一步深入研究。

人Boca病毒外壳蛋白VP2在杆状病毒中的表达及病毒样颗粒的构建

为了得到结构与功能更接近于天然病毒的人Boca病毒（HBoV）主要外壳蛋白VP2,将来源于北京急性呼吸道感染患儿标本（BJ3722）的HBoV VP2基因编码区克隆至杆状病毒表达转移载体（pFastBac1）,通过转座反应获得重组Bacmid DNA,以这种DNA转染昆虫细胞Sf9。收获重组病毒及其昆虫细胞培养物,经SDS-PAGE并应用兔抗HBoV VP2高价免疫血清进行Western blot,以检测所表达的VP2蛋白。昆虫细胞经重组病毒感染后7~10d细胞完全裂解时,收获培养上清（VLPs-A）,或在感染后4~5d细胞裂解前收获细胞并将其裂解（VLPs-B）,经两次40%的蔗糖垫超速离心,所得的样品经Western blot和间接免疫荧光方法（IFA）检测,以确定VLPs的组分,然后应用免疫电镜观察病毒样颗粒的形态结构。通过考马斯亮蓝染色和Western blot检测,均可检测到分子量约61kD的目的蛋白;通过IFA在重组杆状病毒感染的Sf9细胞中检测到特异性荧光,表明HBoV VP2蛋白得到了表达并具有抗原特异性。纯化后的样品在电镜下可见类似于天然细小病毒B19的直径20nm左右的具有空壳结构的球形颗粒。本研究成功构建了HBoV VP2重组杆状病毒,得到了具有抗原特异性的HBoV VP2蛋白表达并形成了HBoV的VLPs。

口蹄疫病毒VP2蛋白特异性单克隆工程抗体的表达与活性鉴定

为了在牛上应用单个B细胞抗体技术制备口蹄疫病毒(FMDV)特异性单克隆抗体,本研究利用生物素标记O型FMDV 146S抗原,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选单个抗原特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,将可变区基因插入含有牛Ig G抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建完整Ig G抗体的表达质粒。将表达质粒转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行抗体表达与纯化。经病毒中和试验(VNT)、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western-blot验证抗体的生物活性。结果显示,获得了4株FMDV特异性单克隆工程抗体,其中2株(A35、B57)可以中和O型FMDV;2株(A7、E32)IFA检测为阳性,其中E32可特异性结合O型和A型FMDV两种抗原,但没有病毒中和活性;ELISA结果显示,E32具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,E32可特异性结合衣壳蛋白VP2,说明在衣壳蛋白VP2存在型间保守的抗原位点,为通用型FMDV抗原检测方法的研究提供了材料。