基于蛋白质组学揭示马齿苋通过抑制Caspase 12蛋白对结直肠炎癌转化小鼠的药效机制研究

目的:探讨马齿苋通过Caspase 12介导的NOD信号通路对结直肠炎癌转化小鼠的保护作用机制。方法:将24只6~8周龄的C57小鼠,随机分为正常对照组、模型组、马齿苋治疗组。模型组和马齿苋治疗组采用氧化偶氮甲烷(AOM)联合葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结直肠炎相关肿瘤发生小鼠模型,马齿苋治疗组每日按照人鼠等效剂量灌胃;通过各组小鼠的脾体比、结直肠长度、肠道息肉/肿瘤总数及肠道组织的苏木精-伊红染色,分析马齿苋抑制小鼠结直肠炎癌转化的药效;通过蛋白组分析、Western blot检测,验证马齿苋对NOD信号通路关键蛋白Caspase 12的调控;分别通过qPCR法和免疫荧光法检测小鼠组织中Caspase 12调控的细胞因子IL-1β、趋化因子和巨噬细胞标志物F4/80的表达;最后采用Alican blue和PAS病理染色检测肠道黏蛋白的水平,使用Western blot检测肠道紧密连接蛋白的水平,以评价马齿苋对肠道屏障的保护作用。结果:马齿苋明显抑制小鼠结直肠炎癌转化进展,减少肠道息肉/肿瘤数量和肠道Ki67水平,马齿苋可显著改善结直肠炎癌转化小鼠NOD样受体信号通路功能,抑制关键蛋白Caspase 12的水平,减少下游细胞因子IL-1β和趋化因子MCP-1含量,减少结直肠炎癌转化小鼠中肠道组织巨噬细胞的表达,改善结直肠炎癌转化小鼠肠道屏障功能。结论:马齿苋能够抑制小鼠结直肠炎癌转化进展,抑制炎症反应,改善肠道屏障,其作用可能与调控Caspase 12介导的NOD样受体信号通路有关。

糖脂清对糖尿病大鼠海马内质网应激相关因子GRP78、CHOP、Caspase-12表达的影响

目的通过观察糖脂清对糖尿病大鼠海马组织的内质网应激相关因子GPR78、CHOP、Caspase-12的影响,探讨其在改善糖尿病大鼠认知功能的作用机制。方法采用高糖高脂饲料联合小剂量链脲佐菌素腹腔注射复制2型糖尿病大鼠模型,并给予糖脂清高、中、低剂量组干预8周后,采用ELISA法检测血清空腹葡萄糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS),计算稳态模型的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、胰岛素敏感指数(ISI);qPCR和Western blot法检测海马组织内质网应激相关因子GPR78、CHOP、Caspase-12的mRNA及蛋白表达水平。结果糖脂清各剂量组均能够显著降低FPG及HOMA-IR(P<0.01),除低剂量组外,糖脂清均可显著提高ISI(P<0.01),3组FINS水平无显著性差异(P>0.05)。与模型组比较,糖脂清低、中、高3个剂量组GRP78mRNA和蛋白相对表达均显著增加,CHOP、Caspase-12mRNA表达均减少(P<0.01),中、高剂量组CHOP、Caspase-12蛋白表达显著减少(P<0.01)。结论糖脂清能够控制血糖,改善胰岛素抵抗,增加胰岛素敏感性,同时能够调节海马内质网应激相关因子GRP78、CHOP、Caspase-12mRNA和蛋白的表达。

Grp78和caspase-12在缺氧心肌细胞中的表达

目的利用体外培养的心肌细胞缺氧模型,观察不同缺氧时间点Grp78和caspase-12在心肌细胞中的表达变化。方法将原代培养的大鼠心肌细胞,随机分为正常对照组,缺氧0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h、4h、8h、12h、16h、24h组,通过TUNEL法检测缺氧心肌细胞凋亡,应用Westernblot法检测不同缺氧时间点Grp78和caspase-12在心肌细胞中的表达。结果与对照组相比,缺氧组细胞凋亡指数随缺氧时间延长逐渐升高;Grp78蛋白于缺氧0.25h开始表达,缺氧1h达到峰值;procaspase-12于缺氧0.5h表达开始增高,2h达到峰值;caspase-12于缺氧1h表达上升,4h达到峰值。结论缺氧激活了内质网应激反应,可引起心肌细胞凋亡。

糖尿病大鼠血管平滑肌细胞内质网应激因子GRP78和caspase12的表达及阿托伐他汀的干预作用

目的观察糖尿病大鼠血管平滑肌细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)相关因子GRP78及caspase12表达的变化,及阿托伐他汀干预对其表达的影响。方法 6-8周龄雄性SD大鼠15只被随机分为对照组、糖尿病组和阿托伐他汀组,每组5只。对照组大鼠腹腔注射双蒸水,双蒸水灌胃;糖尿病组大鼠腹腔注射1%链脲佐菌素溶液(60 mg/kg),双蒸水灌胃;阿托伐他汀组大鼠腹腔注射1%链脲佐菌素溶液按(60 mg/kg),阿托伐他汀10 mg/(kg·d)灌胃。实验第8周末,检测大鼠血糖、动脉收缩压(SBP)及心率(HR)、脉搏波传导速度(PWV)和主动脉壁中层厚度;免疫组化及Western Blot检测各组大鼠主动脉血管平滑肌组织中GRP78及caspase12蛋白的表达变化。结果对照组大鼠血糖水平为(3.56±2.52)mmol/L;糖尿病组大鼠血糖水平为(22.85±5.73)mmol/L,显著高于对照组(P<0.01);阿托伐他汀组大鼠血糖水平为(20.32±6.51)mmol/L,与糖尿病组差异没有统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,糖尿病组大鼠SBP、PWV及主动脉壁中层厚度均明显增高(P<0.05);与糖尿病组相比,阿托伐他汀组大鼠SBP略有降低(P>0.05),PWV及主动脉壁中层厚度均明显降低(P<0.05)。免疫组化结果显示,对照组大鼠平滑肌细胞GRP78及caspase 12表达呈弱阳性表达;糖尿病组GRP78及caspase12呈强阳性表达,显著高于对照组(P<0.01);阿托伐他汀组GRP78及caspase12则呈阳性表达,明显低于糖尿病组(P<0.05)。Western blot结果显示,与对照组相比,糖尿病组大鼠血管平滑肌组织GRP78及Caspase 12蛋白表达量均显著升高(P<0.01);与糖尿病组相比,阿托伐他汀组大鼠血管平滑肌组织GRP78及caspase 12蛋白表达量均明显降低(P<0.05)。结论糖尿病大鼠血管平滑肌细胞ERS激活,应激因子GRP78及caspase12表达升高,caspase12诱导促凋亡信号途径激活,对血管平滑肌细胞起损害作用,可能是糖尿病血管病变的分子机制之一;阿托伐他汀可下调GRP78及caspase12表达,抑制血管平滑肌细胞ERS激活,对糖尿病大鼠血管平滑肌起保护作用。

深低温处理脊髓缺血再灌注后Caspase12的表达情况

目的：观察深低温对大鼠脊髓缺血再灌注的保护作用及对Caspase12表达的影响，初步探讨其可能的作用机制。方法：将45只SD大鼠随机分为3组：深低温18℃处理组（A组）；常温手术对照组（B组）；常温假手术组（C组）。每组分为6h、24h、1周三个不同时间点取L2～L5段的脊髓，每个时间点5只大鼠，采用普通病理HE染色、Nissl染色、电镜从形态学上观察脊髓组织，免疫组化检测和RT—qPCR检测缺血再灌注后脊髓组织Caspase12蛋白和mRNA的表达变化。结果：组织形态学观察A、B组病理改变均较c组严重，且A组比B组轻．病理学累积评分A、c组明显低于B组（P〈0．01）；免疫组化检测和RT-qPCR检测结果分别显示，Caspase12蛋白和mRNA在A、B组各时间段均高于C组，且A组升高程度比B组低（P〈0．05）。结论：深低温对大鼠脊髓缺血再灌注有保护作用。并且可能通过抑制Caspase12的表达而发挥其保护作用。

反式白藜芦醇对Aβ_(25-35)致痴呆大鼠海马caspase12的影响

目的观察反式白藜芦醇(TR)对β淀粉样蛋白(Aβ25-35)致痴呆大鼠海马caspase12 mRNA和蛋白表达的影响,补充说明TR抗痴呆的作用机制。方法大鼠随机分为五组:假手术组、阳性对照组、模型组、低剂量组、高剂量组,每组9只。在大鼠海马给予Aβ25-35造模结束后连续灌胃15 d每日1次,阳性对照组给予多奈哌齐1mg/kg,低剂量给予TR10mg/kg,高剂量TR40mg/kg,假手术组和模型组给予同体积的生理盐水。第15天时处死大鼠,免疫组化及Western blot检测海马caspase12蛋白表达,实时定量PCR检测海马caspase12 mRNA的表达。结果大鼠注射Aβ25-35后,模型组海马caspase12蛋白和mRNA表达明显高于假手术组(P<0.01)。TR剂量依赖性地降低了大鼠caspase12蛋白表达和mRNA表达(P<0.05)。结论 TR抗Aβ25-35致痴呆大鼠的作用机制与抑制海马caspase12基因表达有关。

IGF-1R基因沉默对L02细胞过氧化损伤时Caspase12表达的影响

目的:成功构建稳定沉默表达IGF-1R基因质粒,并转染至L02细胞(人正常肝细胞),观察IGF-1R基因沉默对L02细胞过氧化损伤时经内质网途径特异性凋亡蛋白Caspase12表达的影响。方法:构建针对L02细胞IGF-1R基因的短发夹状RNA(shRNA),将4种不同序列的Sh-H-IGF1R-1108、Sh-H-IGF1R-2797、Sh-H-IGF1R-3215、Sh-H-IGF1R-3787质粒(设为实验组)以及含与IGF-1R无关序列的Sh-H-IGF1R-V1质粒(设为阳性对照组)和空白质粒Sh-H-IGF1R-V2(设为阴性对照组)分别转染L02细胞,24 h后用RTPCR方法检测IGF-1R表达水平,筛选出稳定沉默IGF-1R基因的质粒。随后进行下一步实验分组:空白对照组(A组)、过氧化损伤组(B组)、阴性质粒转染组(C组)、目的基因转染组(D组)。12 h后收集细胞,采样待测,用Western Blot法检测各组Caspase12表达。结果:各实验组与Sh-H-IGF1R-V1组及Sh-H-IGF1R-V2组比较扩增倍数均降低(P<0.05),其中Sh-H-IGF1R-3215组(0.02±0.01)与Sh-H-IGF1R-3787(0.05±0.05)沉默效果最稳定,但后组重复性更好。B组(2.41±0.03)、C组(2.45±0.02)、D组(3.60±0.06)Caspase12表达均较A组(0.34±0.02)升高(P<0.01),C组较B组略升高(P>0.05),D组较B、C组显著升高(P<0.01)。结论:4种针对IGF-1R基因沉默质粒均构建成功,并成功转染至人L02细胞(人正常肝细胞),沉默效果最理想的质粒为Sh-H-IGF1R-3787。IGF-1R靶向shRNA质粒可通过沉默L02细胞IGF-1R表达加重细胞凋亡,间接验证了IGF-1/IGF-1R信号通路对L02细胞过氧化损伤时经内质网途经的细胞凋亡程序活化有一定的调控作用。

独活和独活香豆素对帕金森病模型大鼠脑黑质CHOP和Caspase12表达的影响

目的:通过观察独活及独活香豆素对乳胞素(Lactacystin)诱导的帕金森病(PD)模型大鼠脑黑质CHOP和Caspase12表达水平的影响,探讨其与内质网应激的关系。方法:利用乳胞素(Lactacystin)脑黑质致密部注射建立PD大鼠模型,于第7、14、21、28天进行阿扑吗啡(APO)检测,根据大鼠行为学异常程度,应用分层随机法将模型复制的大鼠随机分为模型对照组、吐温80组、独活香豆素组、独活颗粒剂组、独活复方颗粒剂组、塞来昔布组、美多芭组七组。另设假手术组和正常对照组,假手术组脑黑质致密部注射等量生理盐水。正常对照组、假手术组、模型对照组用生理盐水灌胃,其他组大鼠同时间予以等体积相应药物灌胃,共10周。给药后第14、28、42、56、70天分别进行APO检测,观察记录其旋转行为异常、旋转方向、旋转圈数。在进行最后一次APO检测后的次日,过量麻醉处死大鼠,断头,取左侧脑黑质,采用RT-PCR、Western-blot法,对大鼠脑黑质CHOP、Caspase12 mRNA及蛋白表达水平进行检测。结果:应用Lactacystin诱导的PD模型大鼠脑黑质CHOP和Caspase12的表达明显上调;予以药物干预后,独活香豆素、独活颗粒剂、独活复方颗粒剂、美多芭、塞来昔布组大鼠脑黑质CHOP和Caspase12的表达均有下降,以独活香豆素和或独活颗粒剂组最为显著。结论:独活和独活香豆素可能是通过抑制内质网应激对PD起到保护作用。

Caspase12在糖尿病大鼠逼尿肌细胞内质网应激中的表达

目的探讨Caspase12在糖尿病大鼠逼尿肌细胞内质网应激中的表达及作用。方法在不同的时间点(4、8、12、16周后诱导1型糖尿病大鼠模型),通过注射链脲菌素诱导糖尿病大鼠模型。在电镜下观察内质网形态,应用TUNEL技术检测糖尿病大鼠膀胱逼尿肌细胞的凋亡水平,采用RT-PCR技术测定逼尿肌细胞内Caspase12 mRNA的表达水平,采用Western-blot技术检测逼尿肌细胞内的Caspase12蛋白表达水平。结果电镜下内质网呈不规则改变,膜表面附着大量核糖体;逼尿肌细胞凋亡水平随着时间延长呈显著升高趋势;Caspase12的mRNA和蛋白水平曲线随病理过程的延长而增加。结论 Caspase12参与糖尿病大鼠逼尿肌平滑肌细胞的内质网应激。

P38MAPK抑制剂对急性肝衰竭大鼠内质网应激反应性凋亡的作用

目的:观察P38MAPK抑制剂SB203580对急性肝衰竭大鼠肝组织Caspase12蛋白表达及肝细胞凋亡的影响,探讨其对急性肝衰竭大鼠肝脏保护作用的机制.方法:72只健康Wistar大鼠随机分3组:对照组(注射生理盐水)、模型组(注射D-Gal/LPS)、抑制剂组(D-Gal/LPS+SB203580).按时间点分为3个亚组,每亚组8只.取血检测丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、总胆红素(total bilirubin,TBIL);HE染色观察肝组织病理学变化;免疫组织化学法检测Caspase12蛋白;二苯胺法检测细胞凋亡率.SPSS18.0统计分析.结果:抑制组12 h肝功、Caspase12蛋白表达和细胞凋亡率均低于模型组;18 h Caspase12蛋白表达与模型组差异无统计学意义,细胞凋亡率高于模型组;模型组12 h出现坏死,抑制组18 h出现坏死.结论:P38MAPK抑制剂SB203580能减少肝衰竭大鼠Caspase12蛋白表达和肝细胞凋亡率,减轻肝细胞坏死,对急性肝衰竭大鼠的肝脏具有保护作用.

白及提取物介导MAPK信号通路下调Caspase-12对骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的影响

探究白及提取物介导MAPK信号通路下调Caspase12对骨关节炎(OA)软骨细胞增殖和凋亡的影响。软骨细胞分为对照组、OA组、OA+白及组、OA+白及+SB203580组。通过10 ng/ml的IL-1β培养软骨细胞24 h以模拟体外OA,加入对应的含有50μg/ml的白及提取物预培养24 h,SB203580(5μmol/L)抑制p38 MAPK通路。检测各组细胞增殖、凋亡、细胞中Caspase-12、p38 MAPK蛋白表达水平。研究发现白及提取物可以通过抑制p38 MAPK通路抑制Caspase12的表达,从而缓解软骨损伤。

Caspase12在ERS介导的肝细胞凋亡中的作用

目的:探讨Caspase12在肝纤维化内质网应激(ERS)介导的肝细胞凋亡中的作用。方法:雄性Wistar大鼠40只,随机分为正常对照4周、8周组和肝纤维化模型4周、8周组,每组各10只。肝纤维化组按0.3ml/100g体重的剂量皮下注射40%CCl4植物油溶液,每隔3天注射一次,造模时间分别为4周和8周;对照组大鼠皮下注射等量植物油溶液。采用TUNEL法检测肝组织中肝细胞凋亡情况;免疫组化检测肝组织中Caspase12蛋白的表达变化;Real-time PCR检测肝组织中Caspase12 mRNA的表达变化。结果:免疫组化及Real-time PCR检测显示肝纤维化4周组大鼠肝组织中Caspase12蛋白及mRNA的表达与正常4周组比较无显著差异;随着肝纤维化程度的加重,肝纤维化8周时大鼠肝组织中Caspase12蛋白及mRNA的表达显著增加;同时TUNEL法检测发现肝纤维化大鼠肝组织中肝细胞凋亡的数目较正常组显著增加。结论:Caspase12可能参与了肝纤维化时ERS介导的肝细胞凋亡过程。

敛肝熄风止颤方对帕金森病大鼠内质网应激相关蛋白的影响

目的观察敛肝熄风止颤方对6-羟基多巴胺(OHDA)诱导的帕金森病(PD)模型大鼠黑质内质网应激相关蛋白的影响,探讨其对PD模型大鼠的神经保护作用及可能机制。方法100只SD大鼠随机分为假手术组15只,造模组85只,采用6-OHDA脑左侧纹状体注射制备PD模型,将成模的60只大鼠随机分为模型组、敛肝熄风止颤方低、中、高剂量组(简称低、中、高剂量组)。低、中、高剂量组分别给予低、中、高剂量(0.36、0.72、1.44 g/kg)敛肝熄风止颤方水煎剂灌胃处理4 w,假手术组及模型组用等容积生理盐水灌胃。采用苏木素-伊红(HE)染色检测脑黑质神经细胞形态学,Western印迹检测脑黑质葡萄糖调节蛋白(GRP)78、钙蛋白酶(calpain)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-12相关蛋白表达情况;逆转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)检测脑黑质GRP78、calpain、Caspase-12基因表达。结果HE染色结果表明,假手术组脑黑质神经元数目较多,形态结构基本正常;模型组神经元形态与结构明显损伤,数量明显减少。与模型组比较,中、高剂量组神经细胞数目明显增多,形态结构改善。与假手术组比较,模型组及低剂量组脑黑质GRP78、calpain、Caspase-12蛋白及mRNA的表达均明显增高(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,中、高剂量组GRP78、calpain、Caspase-12蛋白及mRNA的表达明显下降(P<0.05,P<0.01),而低剂量组仅calpain蛋白及mRNA的表达明显下降(P<0.05)。结论敛肝熄风止颤方可能通过抑制PD模型大鼠中脑黑质神经细胞内质网应激,对PD产生神经保护作用。

未折叠蛋白反应参与小鼠急性肾缺血/再灌注损伤

目的探讨未折叠蛋白反应(UPR)在小鼠急性肾缺血/再灌注损伤中的作用。方法将C57B6小鼠分为正常、假手术组和0、4、12、24 h手术组(分别于术后0、4、12和24 h处死小鼠),留取各组小鼠的左侧肾脏。苏木精-伊红(H-E)、过碘酸雪夫反应(PAS)和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)染色观察各组肾脏组织学变化,Western印迹法和实时聚合酶链反应(PCR)检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和caspase12在各组小鼠肾组织中的表达。结果H-E、PAS染色可见24 h手术组的肾小管上皮细胞坏死明显,病变最重的部位为外髓外带近端小管,肾小管坏死评分为(2.930 0±0.131 1)分,显著高于其他组(P值均<0.01)。TUNEL染色可见24 h手术组的肾小管上皮细胞凋亡指数为(36.17±7.53)%,显著高于其他各组(P值均<0.01)。Western印迹法结果显示,12 h手术组的GRP78和caspase12蛋白水平显著高于其他各组(P值均<0.01)。实时PCR结果显示,4 h手术组的GRP78和caspase12 mRNA水平显著高于其他各组(P值分别<0.01、0.05)。结论在夹闭左侧肾动脉致急性肾缺血/再灌注损伤模型中,小鼠左侧肾脏组织学损伤显示再灌注后24 h最严重。GRP78和caspase12在再灌注后其mRNA和蛋白表达水平明显升高或激活,其变化早于组织学改变。提示UPR可能在急性肾缺血/再灌注损伤中发挥重要作用。

高同型半胱氨酸血症经内质网途径影响ApoE-/-鼠肝细胞凋亡

目的观察高同型半胱氨酸血症(HHcy)对ApoE-/-鼠肝细胞凋亡的影响并探讨其可能机制。方法 36只ApoE-/-小鼠随机分为3组,每组12只:①ApoE-/-对照组(ApoE-/-group):普通饮食饲养;②蛋氨酸饮食组(methionine diet group):普通饮食+1.7%蛋氨酸饲养;③干预组(treatment group):普通饮食+1.7%蛋氨酸+0.006%叶酸及0.0004%VitB12饲养。另取12只正常C57 BL/6J小鼠给予普通饮食,作为正常对照组(normal control group)。饲养20周后,ELISA测定血清同型半胱氨酸(Hcy)浓度和肝组织Caspase-12含量;全自动生化分析仪测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性;DAPI染色法观察肝组织细胞核形态;电镜观察肝脏组织细胞超微结构。结果与正常对照组和ApoE-/-对照组相比,蛋氨酸饮食组Hcy浓度分别增高2.4倍(P<0.01)和2.5倍(P<0.01);ALT活性分别增高2.0倍(P<0.05)和1.2倍(P<0.05);各组AST活性无明显差异;肝组织切片DAPI染色及电镜结果显示,蛋氨酸饮食组小鼠肝细胞出现凋亡的形态学改变,蛋氨酸饮食组小鼠肝细胞线粒体肿胀、浓缩,内质网大量增生,可见细胞凋亡前体及凋亡小体;Caspase-12活性检测显示蛋氨酸饮食组较正常对照组增高(P<0.05)。与蛋氨酸饮食组比较,干预组小鼠血清Hcy浓度降低,Caspase-12活性下降,肝细胞病理变化减轻,血清ALT活性明显降低。结论 HHcy可能通过影响ApoE-/-鼠内质网功能改变,引起肝细胞凋亡。

芪卫颗粒含药血清通过Caspase12途径减轻高糖环境下肾足细胞损伤的机制研究

目的:观察芪卫颗粒(QWG)含药血清对高糖环境下肾足细胞Caspase12凋亡途径的影响,探讨其保护足细胞损伤的作用机制。方法:将体外培养的条件永生系小鼠足细胞分为正常组,甘露醇组,模型组,QWG高、中、低浓度组。干预24h后,罗丹明-鬼笔环肽染色观察足细胞骨架结构;CCK8法、Annexin V-FITC/PI双染色法检测高糖环境下足细胞活力及凋亡情况;免疫细胞化学检测Caspase12及GRP78蛋白表达变化,Western blot检测足细胞标志蛋白Nephrin水平。结果:QWG含药血清能够增加高糖环境下足细胞活力(P<0.05,P<0.01),减少细胞凋亡,改善足细胞骨架结构,增加Nephrin表达(P<0.05),同时降低高糖环境下足细胞内质网应激GRP78及Caspase12蛋白水平(P<0.05,P<0.01)。结论:芪卫颗粒含药血清能够保护高糖环境下足细胞损伤,与内质网应激介导的Caspase12凋亡途径相关。

SGLT2抑制剂达格列净对糖尿病肾病的保护机制研究

目的探讨SGLT2抑制剂达格列净(SGLT2i)对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)小鼠的作用,为临床治疗DN提供实验室依据.方法选用10周龄雄性db/db小鼠(n=21 DN模型)和10周龄雄性wt小鼠(n=20野生模型),随机分wt组(未治疗野生组)、wt+SGLT2i组(治疗野生组)、db/db组(未治疗DN组)、db/db+SGLT2i组(治疗DN组).连续饲养12周,确定制成DN模型后,给予SGLT2i达格列净灌胃,8周后取材,行生化检查、病理、免疫组化、蛋白印迹及TUNEL染色.结果和wt组比较,db/db小鼠DN组血糖、肾质量/体质量比、血肌酐、24 h尿蛋白及尿微量白蛋白与肌酐的比值(UACR)均明显升高,而体质量明显降低(均P<0.05).与db/db组比较,db/db+SGLT2i达格列净组UACR、24 h尿蛋白、血肌酐及血糖水平明显降低,体质量也有所减轻(均P<0.05),但肾质量/体质量比值无明显变化.组织病理学结果显示:与wt组比较,db/db组肾小球鲍曼间隙缩小,肾小球基底膜增厚,系膜基质扩张,系膜细胞增生.与db/db组比较,db/db+SGLT2i达格列净组上述病理改变均减轻.透射电镜观察肾脏的超微结构结果显示:与wt组比较,db/db组肾小球基底膜增厚,膜滤过层结构不清,足细胞足突紊乱,间隙增宽,系膜基质增多.与db/db组比较,db/db+SGLT2i组的上述症状明显减轻,表明SGLT2i达格列净可以减轻db/db小鼠的肾脏损伤.与wt组比较,db/db DN组小鼠肾小管上皮细胞凋亡明显升高,与db/db组比较,db/db+SGLT2i达格列净组细胞凋亡明显降低(P<0.05).结论SGLT2i达格列净可减轻db/db小鼠的肾损伤;SGLT2i达格列净可减少db/db DN小鼠模型的细胞凋亡及ERS途径相关蛋白Caspase12蛋白的表达;SGLT2i达格列净对DN小鼠有保护作用,其可能的机制与改善ERS细胞凋亡途径有关.

内质网应激及介导细胞凋亡信号转导研究进展

近年来,内质网应激(ERS)和它所诱导的细胞凋亡被认为在慢性疾病、神经退行性疾病、癌症和糖尿病等疾病的病理生理中发挥重要作用。当内质网(ER)正常功能紊乱时,会扰乱细胞内环境,引起ERS,从而激活一系列进化保守的自我保护性信号通路统称为未折叠蛋白质反应(UPR)。最初,UPR旨在恢复ER内部平衡,保护细胞存活,但如果这些尝试失败,UPR将转而激活凋亡级联反应,导致细胞凋亡。文章对ERS反应进行介绍,综述了ERS激活跨膜蛋白激酶(IRE1)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、活化转录因子6(ATF6)介导的促存活通路及ERS介导的包括增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、半胱天冬氨酸蛋白12(Caspase12)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等促细胞凋亡途径的可能机制。

电针对脑缺血-再灌注损伤大鼠运动功能的改善作用及机制研究

目的探讨电针对缺血性脑损伤后GRP78和caspase12的影响及对大鼠肢体运动功能修复的影响及机制。方法本实验使用改良线栓法制备大鼠脑缺血-再灌注模型(MCAO),对"百会"和"水沟"穴电针刺激,电针干预时间30min。SD大鼠随机分为对照组(sham组)、脑缺血-再灌注(3h、6h、12h、24h、72h、120h)组(I/R组)和再灌注时间点+电针组(I/R+EA组),每组5只,转棒式疲劳仪实验检测大鼠肢体运动功能的修复状况,RT-PCR检测caspase-12 mRNA的表达,免疫荧光实验检测GRP78蛋白的表达。结果 I/R+EA组(7d和14d)大鼠在转棒上停留时间与对应I/R组相比显著延长,差异有统计学意义(P<0.05),显示电针干预能促进大鼠运动功能的修复;I/R+EA组(3h、6h、12h、24h、72h和120h)缺血侧脑组织caspase12 mRNA的表达与对应I/R组相比显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),I/R+EA组(3h、6h、12h和24h)GRP78阳性细胞数与对应I/R组相比显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论电针干预能促进缺血性脑损伤大鼠肢体运动功能修复可能与阻断内质网介导的凋亡通路有关。

丹参预处理对肝脏缺血再灌注损伤后磷酸化真核生物翻译起始因子2α和caspasel2的影响

目的观察丹参预处理对肝脏缺血再灌注损伤后磷酸化真核生物翻译起始因子2d（p-elF-2a）和caspasel2表达的影响。方法将80只Wistar大鼠按随机数字表法分成正常对照组5只，假手术组、缺血再灌注组和丹参预处理组各25只，后3组大鼠再根据缺血再灌注时限（0、3、12、24和72h）分为5个亚组，每组5只。采用动脉夹钳夹肝蒂45min后，使血液复流的方法制备大鼠缺血再灌注损伤模型。正常对照组大鼠不做处理；假手术组仅解剖肝门不钳夹肝蒂；丹参预处理组大鼠在肝血流阻断前30min经尾静脉注入丹参注射液6ml／kg；假手术组和缺血再灌注组大鼠则在肝血流阻断前30min经尾静脉注入等量生理盐水。采用Westernblot检测各组大鼠肝组织中p-eIF-20α和caspasel2蛋白的表达，HE染色观察各组大鼠同期肝组织的病理形态学变化。多组间比较采用单因素方差分析，组间比较方差齐采用LSD法，方差不齐采用Games-Howell法。结果正常对照组大鼠肝组织中p-eIF-20α蛋白的相对表达量为0．296±0．038，假手术组在缺血再灌注0、3、12、24和72h分别为0．304±0．048、0．298±0．038、0．272±0．042、0．266±0．076和0．296±0．043，两组比较，差异无统计学意（P〉0．05）。缺血再灌注组大鼠肝组织中p-eIF-2α蛋白的相对表达量在缺血再灌注0h为0．310±0．034，与正常对照组和假手术组同时相点比较，差异无统计学意义（F=0．15，P〉0．05）；在缺血再灌注3、12、24h，p-eIF-2α蛋白的相对表达量分别为0．386±0．021、0．710±0．034和0．474-4-0．017，与正常对照组和假手术组同时相点比较，差异有统计学意义（F=11．90，211．52，25．15，P〈0．05）；至缺血再灌注72h，p-eIF-2α蛋白的相对表达量为0．336±0．043，基本回落至正常对照组和假手术组同时相点水平（F=1．57，P〉0．05）。丹参预处理组大鼠肝组织中p-eIF-2α蛋白的相对表达量在缺血再灌注0、12、24和72h分别为0．278±0．044、0．800±0．079、1．056±0．125、0．736±0．087和0．442±0．047，丹参预处理组在缺血再灌注3、12、24、72h明显高于缺血再灌注组同时相点水平（P〈0．05）。正常对照组大鼠肝组织中easpasel2蛋白的相对表达量为0．983±0．003，假手术组在缺血再灌注0、3、12、24和72h分别为0．974±0．004、0．9834-0．005、0．985±0．003、0．981±0．004和0．978±0．004，两组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。缺血再灌注组大鼠肝组织中caspasel2蛋白的相对表达量在缺血再灌注0h开始上升为1．018±0．076，但与正常对照组和假手术组同时相点比较，差异无统计学意义（F=1．43，P〉0．05）；在缺血再灌注3h明显升高为2．056±0．067，12h达到峰值为2．804±0．050，24h仍处于相对高水平为1．882±0．037，72h有所下降为1．282±0．066，与正常对照组和假手术组同时相点比较，差异均有统计学意义（F=1290．69，6490．84，2898．71，103．61，P〈0．05）。丹参预处理组肝组织中caspasel2蛋白的相对表达量在缺血再灌注0、3、12、24、72h分别为0．998±0．056、1．442±0．066、1．990±0．068、1．364±0．056和0．962±0．054，缺血再灌注3、12、24、72h均明显低于缺血再灌注组同时相点（P〈0．05）。病理形态学检测结果显示：正常对照组和假手术组大鼠肝组织肝小叶结构基本完整，肝细胞连续成索，胞核大而圆；肝缺血再灌注组大鼠肝组织可见肝小叶变形，细胞体积变小，细胞核浓缩，部分出现片状坏死；丹参预处理组大鼠肝细胞肿胀，出现轻微的点状坏死。结论丹参可能通过上调p-eIF-2α的水平稳定内质网内环境，减轻经内质网细胞凋亡途径中caspasel2的表达，在肝脏缺血再灌注损伤期发挥肝脏保护作用。