DNase Ⅰ预处理和样本储存时间对血浆中性粒细胞胞外诱捕网相关指标检测结果的影响

目的 分析DNase Ⅰ预处理和样本储存时间对血浆样本中性粒细胞胞外诱捕网(NET)检测结果的影响。方法 随机筛选无基础疾病且无吸烟史的4名体检健康者,采集其外周血,提取血浆,检测NET的4个代表性指标[双链DNA(dsDNA)、瓜氨酸化组蛋白3(citH3)、核小体、髓过氧化物酶(MPO)-DNA复合物]。分析DNase Ⅰ预处理血浆对MPO-DNA复合物检测结果的影响。将样本采集2.5 h的检测结果作为基线值,比较样本于4℃低温冰箱放置12、24、48 h后,4项指标检测结果的差异。结果 经DNase Ⅰ预处理和未经DNase Ⅰ预处理血浆MPO-DNA复合物检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。血浆样本于4℃低温冰箱放置12、24、48h,dsDNA、MPO-DNA复合物含量稳定,各时间点检测结果差异无统计学意义(P>0.05);citH3在样本放置24 h时有所升高,核小体在样本放置12 h时有所降低,但各时间点检测结果差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 DNase Ⅰ预处理血浆对MPO-DNA复合物的检测结果无影响。血浆样本在4℃低温冰箱放置48 h NET的4个代表性指标均相对稳定,但建议在样本采集12 h内尽快冻存血浆样本。

DNase1L3分泌减少和相关抗体诱发散发性SLE患者NET降解障碍

目的 探讨DNA酶1(DNase1)和DNA酶1样分子3(DNase1L3)活性改变与散发性系统性红斑狼疮(SLE)患者人群中中性粒细胞胞外诱捕网(NET)降解受损相关性及发生机制。方法 募集46例散发性SLE患者和30名正常个体,采用ELISA检测DNase1、 DNase1L3及相应自身抗体,免疫沉淀法分离样本DNase1和DNase1L3,改进的免疫荧光法检测NET和酶降解活性,酶联免疫斑点实验(ELISPOT)、 Western blot法和反转录PCR分析外周血单个核细胞(PBMC)分泌DNase1L3能力。结果H3-dsDNA和Ela-dsDNA两种复合物在SLE人群中的水平显著升高;低密度中性粒细胞(LDG)在SLE人群中的水平显著高于正常人群,LDG与H3-dsDNA和Ela-dsDNA两种NET复合物具有显著正相关性。SLE患者血浆体外降解NET的能力显著低于正常人群;DNase1和DNase1L3不同比例的综合降解实验显示DNase1L3降低是影响NET残留升高的关键;SLE患者人群DNase1L3自身抗体也显著高于正常人群;SLE患者PBMC分泌DNase1L3的能力相对正常人群减退。结论 DNase1L3分泌减少和相关自身抗体的存在是SLE人群NET降解能力减退的主要因素,为SLE患者病情监测和治疗提供新的方向。

DNASE1L3基因变异致狼疮性肾炎的临床及遗传学分析——附1例病例报道及文献复习

目的:分析DNASE1L3基因缺陷导致狼疮性肾炎(LN)患者的临床病理表现及基因变异特征。方法:结合1例伴肺出血的LN患者全外显子测序分析结果,总结DNASE1L3基因缺陷致LN患者的临床特征及致病变异谱。结果:该患者为男性,23岁起病,肾脏表现为大量蛋白尿及镜下血尿,肾活检病理提示LN-Ⅴ+Ⅳ型,合并肺出血、重度贫血、荨麻疹样皮疹、关节炎等表现。全外显子测序检出DNASE1L3基因c.565_568del(p.D189Sfs*17)纯合致病变异,该变异此前未见报道。文献检索报道了25例DNASE1L3基因缺陷致LN病例,结合本病例,共发现9个DNASE1L3基因致病变异位点,53.8%患者为男性,78.6%有血液系统受累,71.4%关节受累,71.4%荨麻疹样皮疹,42.9%肺部受累,35.7%消化系统受累,21.4%眼部受累,21.4%心脏受累,57.7%伴抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)阳性,50%预后不佳。结论:DNASE1L3基因缺陷更常见于男性LN患者,易累及血液系统、关节、皮肤、肺和消化系统,可伴ANCA阳性。对于LN伴ANCA阳性或肺出血的患者,应仔细询问家族史,及时完善基因检测,考虑DNASE1L3基因缺陷可能性。

雌二醇诱致大鼠垂体催乳素瘤形成过程催乳素基因DNase Ⅰ敏感位点增加

ＤＨａｓｅⅠ敏感位点的存在，是染色质水平上基因活化调节的重要基础之一。为探讨Ｅ２诱发垂体ＰＲＬ瘤形成的表基因机制，本工作观察了Ｅ２诱致的垂体催乳素瘤催乳素基因ＤＮａｓｅⅠ敏感位点的改变。结果表明：Ｅ２诱致大鼠垂体前叶ＰＲＬ瘤细胞ＰＲＬ基因的ＤＮａｓｅⅠ敏感位点较正常大鼠增多，提示在Ｅ２诱发ＰＲＬ瘤形成过程中，ＰＲＬ基因处于活化状态。

糖尿病肾病大鼠肝DNA甲基化酶活性及基因组DNA对DNase敏感性的分析

用 3H标记的 S-腺苷酰 - L -甲硫氨酸 (3H- SAM)作为甲基供体 ,以同位素掺入法测定了正常大鼠、糖尿病肾病大鼠、中药“糖微康”治疗的糖尿病肾病大鼠、西药“开博通”治疗的糖尿病肾病大鼠的肝细胞的 DNA甲基化酶活性 ,并对从以上各组动物肝组织中提取的基因组 DNA分别进行 DNase 敏感性分析 .结果显示 :糖尿病肾病大鼠肝 DNA甲基化酶活性明显低于正常鼠肝 ,其基因组 DNA对 DNase 敏感性比正常大鼠肝增强 ;中药“糖微康”治疗及西药“开博通”治疗的大鼠的肝 DNA甲基化酶活性均有所回升 ,且中药组更接近正常大鼠对 DNase 的敏感性 .

DNase处理法结合数字PCR与qPCR对活的非可培养状态副溶血性弧菌检测比较研究

目的探讨DNase处理法结合微滴化数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)在检测冷冻食品中活的非可培养状态(viable but non-culturable state, VBNC)副溶血性弧菌的适用性,并与实时荧光定量PCR(qPCR)进行比较。方法用无菌磷酸盐缓冲液对解冻的大西洋鲑鱼样品进行10倍梯度稀释,再加入副溶血性弧菌,终浓度为6.6×10^5 CFU/mL。-20℃分别诱导10、20和30 d。将DNase试剂与叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)染料分别作用于不同时期的冷冻基质,结合qPCR和ddPCR进行比较检测,对比其作用效果。结果DNase-qPCR和PMA-qPCR检测3个冷冻阶段活性副溶血性弧菌的Cq值分别为31.41±0.06、32.40±0.04、34.59±0.15和31.24±0.06、32.32±0.03、34.25±0.12, 2种方法Cq值均呈现上升的趋势且数值接近。采用DNase-ddPCR和PMA-ddPCR检测各阶段活性副溶血性弧菌,可直接读出绝对拷贝数,分别为233±6.43、108±5.57、28±3.21和256±6.56、126±3.06、35±2.52。2种方法检测的拷贝数差异不大,重复性好。相对标准偏差均在可接受范围内,符合欧盟定量检测要求。结论DNase处理试剂与PMA对有活性的副溶血性弧菌检测效果相当,与PMA相比,DNase处理法无需强光照射,操作简便快捷,无试剂毒性。ddPCR不需要标准品即能实现对基质中微量活性副溶血弧菌精准定量检测。

牛胰腺DNaseⅠ基因的合成、表达及功能验证

从NCBI下载牛胰腺DNaseⅠ蛋白序列,利用密码子优化软件(Codon Optimization)进行序列优化,设计并合成24条首尾重叠的引物合成786bp的DNaseⅠ基因,构建重组载体pET30a-DNaseⅠ,转入BL21(DE3),ArcticExpress(DE3),BL21(DE3)pLysS 3种感受态中诱导表达后,纯化目的蛋白并验证其活性.结果表明:BL21(DE3),ArcticExpress(DE3)两种感受态菌落生长异常,且未纯化到目的蛋白,BL21(DE3)pLysS感受态菌落生长正常,但未经诱导和葡萄糖诱导表达的菌液中也未纯化到目的蛋白,IPTG诱导扩大培养的菌液中纯化到0.15 mg/mL的目的蛋白.经验证,酶原液能彻底消化λ-DNA和不同大小的质粒DNA,酶稀释液消化产物电泳检测显示条带拖尾弥散,表明酶稀释液只能消化部分λ-DNA.

DNase Ⅰ对非黏液型和黏液型铜绿假单胞菌生物膜的影响

目的研究不同浓度DNase Ⅰ对非黏液型和黏液型铜绿假单胞菌生物膜形成及成熟生物膜的影响。方法分光光度计法检测25、501、00 U/ml的DNase Ⅰ对非黏液型铜绿假单胞菌PAOⅠ和黏液型铜绿假单胞菌PA17生长曲线的影响;改良平板培养法建立生物膜模型,分别在生物膜形成过程中及生物膜形成后用25、50、100 U/ml的DNase Ⅰ处理,扫描电镜观察PAO Ⅰ和PA17的生物膜形态。结果随着DNase Ⅰ浓度增加,PAO Ⅰ和PA17的对数生长期延迟,但最终不能抑制细菌生长;25 U/ml的DNase Ⅰ即可抑制不同类型铜绿假单胞菌生物膜形成且分解成熟生物膜,100U/ml的DNase Ⅰ可完全阻止铜绿假单胞菌生物膜形成并彻底分解成熟生物膜。结论DNase Ⅰ不能直接杀灭铜绿假单胞菌,但可有效抑制铜绿假单胞菌生物膜形成并分解成熟生物膜,对非黏液型和黏液型铜绿假单胞菌生物膜的影响无明显差异,作用效果呈浓度依赖性。

A组β-溶血性链球菌DNase B基因序列的克隆与序列分析

目的 克隆A组β -溶血性链球菌 (GroupAStreptococcus,GAS)DNaseB基因序列。 方法 根据genBank中登录的多种DNA酶B的序列 ,进行同源性分析 ,设计相对保守的针对DNaseB基因的引物 ,以链球菌基因组为模板进行PCR扩增 ,目的片段经TA克隆至pMD18-T质粒后测定其核酸序列 ,然后进行序列的查询与比对。结果 成功克隆出A组链球菌DNaseB基因全长序列共 810bp ,其中包括中 12 8bp的信号肽编码区和 6 81bp的成熟肽编码区 ,以及 5’端非编码区的一个T。结论 A组 β-溶血性链球菌DNaseB基因序列的成功克隆 。

DNase-I纯化结合碱性裂解法提取混合斑精子DNA

目的研究脱氧核糖核酸酶I(DNase-I)纯化结合碱性裂解法提取混合斑精子DNA的方法在法医学中的应用。方法收集79份性犯罪案件混合斑检材,分别用DNase-I纯化结合碱性裂解法和差异裂解法提取精子DNA,采用STR荧光标记复合扩增体系进行16个STR基因座分型,并比较检验结果。结果应用DNase-I纯化结合碱性裂解法提取精子DNA,64例检材分型成功;应用差异裂解法提取精子DNA,57例检材分型成功;两种方法比较结果存在显著性差异(P=0.039),DNase-1纯化结合碱性裂解法提取精子DNA的STR分型成功率更高,成本低廉。结论DNase-I纯化结合碱性裂解法提取混合斑精子DNA可提高检验成功率,操作简便,快速,易于自动化,适于法医学个体识别鉴定。

RNA促进小鼠重组染色质白蛋白基因DNaseⅠ消化敏感性

同样的基因在不同的分化细胞中表达不同,基因的选择性表达问题涉及分化和衰老的本质。转录基因对DNaseⅠ(DNA酶Ⅰ)消化敏感,本文研究了RNA对小鼠重组染色质白蛋白基因DNaseⅠ消化敏感性的影响。分离BALB/c小鼠脑细胞核,加入终浓度为2mol/L的NaCl破坏核小体结构,加入不同量、不同来源的RNA,装透析袋,逐渐降低离子强度进行染色质重组。重组染色质中加入DNaseⅠ消化DNA,PCR扩增白蛋白基因的外显子1到外显子2约1200bp区段,PAGE电泳后,用银染色观察不同来源RNA促进DNaseⅠ对白蛋白基因的消化作用。不同组织来源(肝、肺、肾、脑)RNA对小鼠重组染色质中白蛋白基因DNaseⅠ消化敏感性均有促进作用,其中肝和肺RNA促进消化作用较强;酵母tRNA无显著促进消化作用;消化促进作用与RNA剂量有关。RNA能增加DNaseⅠ对白蛋白基因的消化敏感性且有组织(细胞)来源特异性。又委托丹麦ChemicalRD实验室合成2条与白蛋白基因互补的各23核苷酸的RNA,用其进行重组试验。结果表明,重组混合物中含有低至0.2μg/mL的RNA,即可以发挥显著的DNaseI消化促进作用。

老年鼠六种组织细胞的细胞核与染色质DNaseⅠ的消化敏感性研究

为探讨衰老的机理，作者研究了老年鼠和断奶乳鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑等６ 种组织细胞的细胞核和染色质对ＤＮＡ 酶Ⅰ（ＤＮａｓｅⅠ）的消化敏感性。结果显示：①老年鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑等６种组织细胞的细胞核和染色质对ＤＮａｓｅⅠ的消化敏感性均较断奶乳鼠相应的组织低；②老年鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑等６ 种组织的消化敏感性各不相同，脑组织的消化敏感性最低（Ｐ＜ ０．０１）；③断奶乳鼠脑组织的消化敏感性也较其它５ 种组织低，但乳鼠中其它５ 种组织细胞核及染色质的消化敏感性差异不明显。作者认为，老年鼠各组织细胞核和染色质转录活性降低，可能与活性基因减少有关。

应用手足口病病原体验证改良的DNase-SISPA方法检测未知病毒感染的特异性

目的以引起手足口病的肠道病毒EV71为研究对象,在DNaseI-非序列依赖的单引物扩增技术的基础上建立感染性疾病RNA病毒性病原体的检测方法。方法根据卫生部发布的《手足口病预防控制指南》(2008年版)附件手足口病实验室检测方案(试行),收集临床诊断手足口病的患儿粪便,经实验室RT-PCR检测阳性后,进行过滤、DNase消化处理。反转录、合成病毒RNA的双链cDNA,Taq I酶切双链cDNA,加接头分子,并以接头分子为引物非特异扩增病原基因,测序并进行序列分析。结果非序列依赖的单引物扩增粪便标本中外源核酸得到多个DNA片段;将所有PCR产物克隆测序,有的序列与已知病原EV71基因序列同源性达99%;有的序列与单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes) strain CDC 54007同源性达81%。结论应用DNase处理及非序列依赖的单引物扩增方法可以检测粪便标本中的RNA病毒性病原,并应用该改良技术检测到单核细胞增生李斯特菌。

人鼻咽癌细胞株中C－Ha－ras基因DNase－I超敏区的序列分析

Ｃ一Ｈａ一ｒａｓ基因的活化与鼻咽癌的发生有关。为了进一步了解ｃ一Ｈａ一ｒａｓ基因在鼻咽癌中的调控模式和活化机制，本文用ＤＮａｓｅ一Ｉ超敏区分析方法对人鼻咽癌细胞株ＨＮＥ２和ＨＯＮＥ１的Ｃ一Ｈｅ一ｒａｓ基因进行研究，发现Ｃ一Ｈａ一ｒａｓ基因启动子部位存在一个重要的ＤＮａｓｅ一Ⅰ超敏区，测序结果表明其ＤＮＡ序列与正常Ｃ一Ｈａ一ｒａｓ基因的相应序列完全等同。提示鼻咽癌细胞中Ｃ一Ｈａ一ｒａｓ基因的调控模式在序列水平与正常细胞中的并无差异。

植物基因组DNase Ⅰ超敏感位点的研究进展

真核生物的基因表达与调控是一系列顺式作用元件(cis-acting element)与反式作用因子(trans-acting fac-tor)相互作用的结果。顺式作用元件本身不编码蛋白,只是基因组中一些特定的区域,它们需与反式作用因子结合才能发挥其生理作用。目前已知,顺式作用元件往往与染色质的结构密切相关,能与反式作用因子结合发挥生物学功能的顺式作用元件,通常存在于脱氧核糖核酸酶I超敏感位点(DNase Ⅰ hypersensitive site)的内部或周围。随着越来越多的植物基因组测序的进展,大规模高通量鉴定植物基因组的顺式作用元件正在受到关注,通过鉴定脱氧核糖核酸酶I超敏感位点可以有效确定顺式作用元件的富集区域,将对功能基因组学研究提供的数据支持。文章综述了近期高通量鉴定和分析植物基因组脱氧核糖核酸酶I超敏感位点研究进展。

鼠脱氧核糖核酸酶(DNase Ⅱα)基因的克隆及原核表达

根据鼠脱氧核糖核酸酶Ⅱ(DNaseⅡ)基因设计引物,通过RT-PCR扩增出鼠DNaseⅡα基因片段,克隆到pMD-18T载体,然后转化至大肠杆菌JM109。经鉴定及序列测定,克隆基因与鼠DNaseⅡα基因序列完全一致,大小为1 008 bp。将重组质粒pMD-DNaseⅡα进行酶切后连接到原核表达载体pET-28a中,重组质粒经PCR和双酶切鉴定及序列分析正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,然后进行初步纯化,Western-blot鉴定。结果表明,本试验成功构建了pET-28a-DNaseⅡα表达载体;表达产物以包涵体形式存在,相对分子质量约为38 800;初步纯化的目的蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带,Western-blot鉴定能与抗体发生特异免疫反应。

基因组探针非试剂盒标记系统中DNaseI用量优化

用10U的DNA Polymerase Ⅰ，一个跨度达百万倍的DNase Ⅰ量，在15℃分别标记了1μg甘蓝型油菜中油821的基因组DNA，发现DNase Ⅰ用量为0．1U时，10min后就可获得较好的探针标记效果．DNase Ⅰ用量为0．01U时，标记2h就显示较深的颜色．随着DNase Ⅰ用量的降低，标记时间需要相应地延长．其用量超过1U时，无法获得较好的探针标记效果．综合考虑DNase Ⅰ用量及标记时间，DNase Ⅰ用量为0．01U、标记时间为3～7h获得的标记效果最佳．

新型辐射增敏药CM对受照肝癌H_(22)细胞DNase作用的研究

本文报道了新型辐射增敏药甲硝唑氨酸(CM)及其与Ca^(+2)结合后对肝癌H_(22)细胞DNase作用,并观察了CM,CMCa及Ca^(+2)和三者分别对受30Gyγ线照射细胞DNase活力的影响。结果表明,CM浓度在10mmol/L以下对H_(22)细胞DNase有激活作用。以5mmol/L时激活作用最强,在5mmol/L以下随药物浓度的增加,激活作用随之增加,CM与Ca^(+2)结合成CMCa后对细胞DNase的激活作用与CM相似,两者无显著差别(p>0.05),CM、CMCa的这种激活作用与γ线照射后对DNase活力增高有叠加作用,而Ca^(+2)对受照或非受照H_(22)细胞DNase活力无明显的影响。上述结果表明,CM及其与Ca^(+2)结合成CMCa后无论对受照或非受照H_(22)细胞DNase均有激活作用。这种通过激活受照肿瘤细胞DNase叠加活力的增加、增强DNA破坏而提高肿瘤放疗效果,可能是其放疗作用的机制之一。

应用Amp-RFLP和SSCP技术分析DNaseⅠ基因的C1978G基因座多态性

为研究人类DNaseⅠ基因点突变C1978G多态性，应用Amp－RFLP和SSCP技术对DNaseⅠ基因C1978G基因座分型，调查173例汉族无关个体，获DNaseⅠ*1978C和*1978G基因频率，即分别为0．5058和0．4942。其基因型频率分布与Hardy-Weinberg平衡吻合，基因座杂合度0．5028，Dp值0．6040，PE值0．1875。经对Iida等介绍的方法作了改良，分型结果稳定可靠，电泳分离时间由18h减至6h。研究证实，DNaseⅠ基因C1978G点突变是一个高多态性基因座，可应用于法医材料的分型调查。

BrdU替代的人外周血淋巴细胞染色体的DNase-1敏感区

用本室建立的染色体原位切口移位方法,详细描述了人淋巴细胞染色体上DNase-1敏感区的分布。与已知的G带、R带图谱和六对已发表的染色体D带图谱比较,表明所揭示的B带与G带、R带和D带有明显的差异,染色体原位切口移位后的DNase—1敏感区多分布在具有转录活性的常染色质区,而异染色质区则通常与失活的基因部位有关。作者对B带的生物学意义和应用价值进行了详细讨论。