鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)背肌中组织蛋白酶B2的纯化与酶学性质鉴定

对鲢鱼背部白肌中的组织蛋白酶B2，进行了分离纯化及酶学性质的鉴定。目的酶经粗提后，再通过酸处理、硫酸铵分级沉淀、超滤、DEAE-Sephacel、Sephacryl S-100、SP-Sepharose F．F．、Blue-sepharose6 F．F．、Con A-Sepharose等步骤纯化，纯化倍数达到396．5倍。经SDS-PAGE分析，该酶呈现了分子量约为25和20KDa的2条带。组织蛋白酶B2的最适反应温度和pH分别为30-35℃和pH5．5。巯基还原剂DTT、L-Cys、pMe均显著地激活了该酶的活性。50μmol／L的E-64能够完全抑制其活性。Cl^-浓度为100μmol／L以内时，对组织蛋白酶B2起到激活作用，200μmol／L时则表现为抑制作用。25mmol／L的P2O7^4-，即可有效抑制该酶的活性。该纯化酶能够水解Z-Arg—Arg-MCA、Z—Phe-Arg—MCA，但是不能够水解L-Arg-MCA。组织蛋白酶B2水解Z—Arg-Arg—MCA、Z—Phe-Arg—MCA的K。值分别为7．15及226μmol／L，表明Z—Arg—Arg—MCA是该酶的最适底物。

Sjcb2 DNA疫苗在血吸虫感染小鼠中的保护性作用研究

目的研究Sjcb2DNA疫苗在日本血吸虫病小鼠模型中的保护性作用和机制,为血吸虫疫苗的研究提供有效的候选抗原分子。方法构建pcDNA3.1(+)/Sjcb2核酸疫苗,将6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为pcDNA3.1(+)/Sjcb2核酸疫苗组、pcDNA3.1(+)空质粒组及生理盐水组,每组35只,采用后腿股四头肌注射方法,每次免疫质粒DNA 100μg,每2周免疫1次,共免疫3次,用日本血吸虫尾蚴攻击感染各组小鼠。PCR及免疫组化法检测Sjcb2基因在小鼠体内的稳定性及表达情况;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖反应;ELISA法检测小鼠血清中Sjcb2抗体水平及攻击感染前后脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的水平;计数小鼠荷成虫对数和肝脏荷虫卵数。结果疫苗组小鼠均可在小鼠肌细胞中检测到Sjcb2基因及其抗原的表达;DNA疫苗组T细胞增殖显著增高(P<0.05);ELISA结果显示疫苗组IFN-γ水平显著增高(P<0.05),血吸虫尾蚴攻击感染后各组小鼠IL-4水平显著升高(P<0.05)。DNA疫苗组小鼠荷成虫对数及肝脏荷虫卵数与其它组比较显著性减少(P<0.05),其减虫率为36.32%,减卵率为60.61%。结论 Sjcb2DNA疫苗接种小鼠后能在小鼠肌细胞中稳定存在和表达;Sjcb2可能通过提高IFN-γ和降低IL-4水平调节Th1细胞亚群产生抗血吸虫感染的保护性作用。

日本血吸虫组织蛋白酶B2在小鼠抗血吸虫再感染中的作用

目的构建日本血吸虫组织蛋白酶B(Sjcb2)真核表达载体,检测日本血吸虫组织蛋白酶B2单独和联合吡喹酮(PZQ)在小鼠抗血吸虫再感染中的作用。方法将60只BALB/c雌性小鼠随机均分为六组,建立日本血吸虫感染动物模型:感染组、感染攻击组、空质粒处理组、Sjcb2免疫组、吡喹酮处理组、Sjcb2联合吡喹酮处理组。Sjcb2免疫组和Sjcb2联合吡喹酮组分别在初次尾蚴感染前第21天、14天及7天接种pcDNA3.1(+)/Sjcb2重组质粒,空质粒处理组接种pcDNA3.1(+)空质粒。初次尾蚴感染后第六周,对吡喹酮处理组和Sjcb2联合吡喹酮处理组小鼠给予PZQ治疗。除感染组外其它各组在第八周再次进行尾蚴攻击感染。分别于第8周和第14周取各组小鼠肝脏组织做病理切片,观察虫卵肉芽肿大小;采用间接ELISA法检测血清中特异性IgE和IgG亚型(IgG1,IgG2和IgG3);检测各组小鼠荷成虫数,计算抗血吸虫再感染率。结果 Sjcb2免疫组、联合组与其它组分别比较,小鼠荷虫数显著性减少,抗血吸虫再感染率显著升高,虫卵肉芽肿直径显著减小,IgG1水平显著下降和IgE水平显著升高(P<0.01)。结论 Sjcb2在小鼠模型中具有抗日本血吸虫再感染作用,抗血吸虫再感染率为70.3%,抗再感染作用机制可能与特异性IgE水平升高和IgG1水平下降有关。