华支睾吸虫组织蛋白酶Cathepsin L1样基因全长序列的克隆和生物信息学分析

目的预测华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中cs002d09号EST序列的结构和功能特征及编码蛋白的应用前景。方法利用NCBI和ExPaSy等生物信息学网站在线分析工具和Vector NTIsuite及PcGene等软件包，分析华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中cs002d09号EST序列及其编码蛋白的理化性质、结构与功能特征。结果BLASTx分析该ESF序列是组织蛋白酶Cathepsin L1的同源基因，全序列长为1458bp，包含完整的编码区80～1191，编码371个氨基酸，前18个氨基酸是分泌信号肽，蛋白的理化性质较稳定。该蛋白有2个空间构象相对独立功能域：N端的抑制功能域和C端的活性功能域，抑制功能域含有3个线性B细胞抗原表位，同源性较低；C端活性功能域同源性较高，Cys177，His318和Asn338组成催化中心，位于底物结合裂缝的底部。结论华支睾吸虫Cathepsin Ll基因与多个物种的Cathepsin L1基因同源，编码蛋白可能是重要的虫体分泌排泄抗原成分，在华支睾吸虫病的免疫诊断和疫苗研究方面有较好的应用前景。

池蝶蚌组织蛋白酶L1-like基因的克隆及表达特征分析

为了解淡水贝类是否存在组织蛋白酶L的亚型及其亚型的免疫相关作用,本实验利用已构建的池蝶蚌血细胞全长c DNA文库,筛选获得与之同源的EST序列,结合RACE技术进一步克隆了池蝶蚌一个新的组织蛋白酶L基因的c DNA全长,命名为Hs Cts L1-like基因(Gen Bank登录号为KF015273)。该序列全长为1280 bp,5′-非翻译区(5′UTR)为31 bp,3′-非翻译区(3′UTR)为256 bp,开放阅读框区(ORF)为993 bp,编码330个氨基酸,预测蛋白相对分子量为36.86 ku,理论等电点为6.23。序列分析结果显示,Hs Cts L1-like与其他软体动物相对应序列具有共同结构特征,包含信号肽、前肽抑制域和成熟肽三部分,在其他物种中已鉴定的Cts L签名序列标签(ERF/WNIN、GNFD、GCXGG和QCHN等)在Hs Cts L1-like中均可找到。其氨基酸序列同缢蛏Cts L1(AGL33704.1)同源性最高,达67%;与报道的三角帆蚌Cts L(ADV03094)和池蝶蚌中另一个Cts L(AEX88474)仅均为52.91%;系统进化分析表明,Hs Cts L1-like与缢蛏、长牡蛎和合浦珠母贝的Cts L1聚为一分支,推测Hs Cts L1-like属于Cts L家族中的亚型1。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测显示,Hs Cts L1-like m RNA在肝脏中表达量最高,其次是卵巢和精巢。注射鳗弧菌后,血细胞和肝脏Hs Cts L1-like m RNA转录水平显著升高,暗示其是一个免疫有关的基因,参与了池蝶蚌的先天免疫应答反应。

斑马鱼Ctsba在脂肪细胞分化中的功能

为了探究斑马鱼(Danio rerio)组织蛋白酶B(Cathepsin B,Ctsb)在脂肪细胞分化中的功能,本文利用基因过表达和敲降技术研究了Ctsb对小鼠脂肪前体细胞(3T3-L1)分化的影响。生物信息学分析显示,斑马鱼基因组中存在2个组织蛋白酶B基因(ctsb):cathepsin ba(ctsba)和cathepsin bb(ctsbb)。其中斑马鱼ctsba编码的氨基酸序列同哺乳动物CTSB的氨基酸序列相似性更高一些,它们的二级结构和三级结构也十分相似。在成体斑马鱼中,ctsba基因在卵巢、脂肪组织、精巢、肌肉、脾、肠、心、肾脏、鳃、脑和肝脏等不同组织中都有表达,其中在卵巢、脂肪组织和精巢中表达较高。通过慢病毒表达载体在3T3-L1细胞中过表达斑马鱼ctsba,可显著增加脂滴的形成;而敲降内源性的ctsb基因则显著减少了脂滴的形成,表明ctsba可促进3T3-L1脂肪前体细胞向脂肪细胞分化。另外,实时定量PCR技术检测显示,斑马鱼ctsba过表达可上调PPARγ、C/EBPα、FAS、ACC1和FABP4等成脂基因的表达,敲降ctsb基因则相反。总之,本研究揭示了斑马鱼Ctsba调控脂肪细胞分化的功能。

大片吸虫组织蛋白酶L1在大肠杆菌中的表达及纯化

利用PCR方法从pET28/FgCL1重组质粒中扩增FgCL1基因,定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建重组质粒pGEX/FgCL1,将该重组质粒转化大肠杆菌BL21中,转化子经IPTG诱导表达。重组蛋白以包涵体形式存在,相对分子质量为61 000。Western-blot、ELISA试验结果显示,纯化后的重组蛋白能被自然感染大片吸虫的牛血清所识别,表达产物具有良好的抗原性。

肝片吸虫组织蛋白酶L1基因cDNA序列的克隆与分析

目的 研制肝片吸虫的候选DNA疫苗。 方法 根据国际发表的相关序列设计引物 ,在引物端加酶切位点 ,应用RT PCR方法。 结果 成功地将肝片吸虫组织蛋白酶L1(FheCL1)基因cDNA序列克隆进真核表达载体 pcD NA3 .1中。对所克隆的FheCL1基因序列及其推导的氨基酸序列进行分析 ,发现其与已发表序列相比 ,核苷酸序列有4.3 %的差异 ;推导的氨基酸序列有 6.9%的差异。两者蛋白质二级结构主要有 3个区域的区别 ,磷酸化位点有 10个不同 ,但共有一由 2 0个疏水氨基酸残基组成的保守区域。 结论 实验构建的 pcDNA3 .1 FheCL1重组质粒是一种新型的抗肝片吸虫DNA疫苗候选重组质粒 ;肝片吸虫可能存在不同的亚种 ,两者的FheCL1基因编码的第 1～ 2 0个氨基酸残基可能组成膜螺旋。

抗大片形吸虫Cat L1单克隆抗体的制备及其双抗体夹心ELISA检测方法的建立

【目的】制备抗大片形吸虫组织蛋白酶L1(rFgCat L1)特异性单克隆抗体,并构建其双抗体夹心ELISA检测方法。【方法】用1 mg/mL rFgCat L1蛋白分4次对5只BALB/c小鼠进行免疫,分离小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合构建杂交瘤细胞,筛选强阳性杂交瘤细胞株,每只小鼠腹腔注射1×10^(6)个细胞制备单克隆抗体。ELISA法检测抗体效价及抗原表位,Western blotting法鉴定抗体亚型和特异性;结合抗rFgCat L1多克隆抗体构建双抗体夹心ELISA检测方法,并检测其敏感性和特异性;用建立的方法对20份阴性血清及阳性血清对照进行检测,筛选其阴阳临界值,并用47份山羊阳性血清及47份奶牛阳性血清对所构建的双抗体夹心ELISA方法进行验证。【结果】免疫后,4只小鼠血清中抗体效价均>10^(4);取小鼠脾细胞与SP2/0融合后,共筛选到8株阳性杂交瘤细胞株,其中5D5和7G6为可稳定分泌抗体的强阳性株,抗体效价分别达2^(9)和2^(10),腹水效价分别达10^(7)和10^(8)。经Western blotting鉴定2株抗体均为IgG1型,轻链为Kappa型,均可特异性结合大片形吸虫排泄-分泌产物(excretory-secretory product,ESP)。由于2株抗体识别相同抗原位点,对比2株单抗的抗体效价,选择以7G6作为捕获抗体,抗rFgCat L1多克隆抗体作检测抗体构建双抗体夹心ELISA法。双抗体夹心ELISA法条件为:7G6以2μg/mL浓度包被,抗rFgCat L1多克隆抗体检测浓度为25μg/mL,酶标二抗稀释度为1∶4000,5%脱脂奶粉封闭,显色时间为25 min。经验证,该方法可识别的最低抗原浓度为0.625μg/mL,并且可特异性识别大片形吸虫抗原。利用构建的双抗体夹心ELISA方法对阳性的奶牛和山羊血清样本进行抗原检测,抗原检出率分别为72.3%及78.7%。【结论】本研究成功制备抗rFgCat L1单克隆抗体并构建大片形吸虫病双抗体夹心ELISA检测方法,结果可为研发低成本、快速诊断试剂盒提供良好的理论依据及物质基础。

大片吸虫成虫cDNA文库的构建和组织蛋白酶L1基因的克隆

目的大片吸虫cDNA文库的构建及组织蛋白酶L1(Fasciola gigantica Cathepsin L1,FgCL1)基因的克隆。方法提取大片吸虫成虫总RNA,运用SMART技术构建大片吸虫cDNA文库。根据文献设计并合成PCR引物,从上述文库中克隆大片吸虫FgCL1基因,定向克隆至原核表达载体pET28a中。结果文库容量为2.08×106pfu/mL,重组率为98%。扩增后的文库滴度为6.23×109 pfu/mL,插入片段平均大小约为1 000 bp。应用两个已知基因(FgCL1 FgGST)从文库中成功钓取到相应的全长基因。将含有FgCL1的阳性克隆测序,用Genebank Blast进行序列比较,证实为FgCL1基因。结论成功构建了cDNA文库,提供筛选大片吸虫基因资源;从该文库中克隆出FgCL1,为进一步表达该基因,研制诊断试剂盒创造了条件。

巨片形吸虫病快速诊断胶体金免疫层析试条的研制与评价

目的建立快速、简便诊断巨片形吸虫病的胶体金免疫层析试条方法。方法提取巨片形吸虫总RNA,通过RT-PCR获得FgCL1-YN基因片段,并克隆入pET28a(+)表达载体,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达得到重组蛋白(r FgCL1-YN);将r FgCL1-YN和羊抗鼠IgG抗体分别包被于硝酸纤维素膜的适宜位置作为检测带和质控带,以胶体金标记抗人IgG4抗体的鼠单抗作为检测试剂,制备检测特异性IgG4型抗体的免疫层析试条。用该试条检测巨片形吸虫病患者(30份)、日本血吸虫病患者(15份)以及健康人(32份)血清,评价其诊断价值,同时用ELISA法进行平行检测作为对照。结果试条检测法的敏感性为100%(30/30),特异性为97.9%(46/47),总体符合率为98.7%(76/77)。ELISA法检测的敏感性、特异性和总体符合率分别100%(30/30)、100%(47/47)和100%(77/77)。试条法与ELISA法的敏感性、特异性和总体符合率,经四格表确切概率法检验,P值分别为1、0.5和0.5,全部大于0.05。显示,试条法与ELISA法检测巨片形吸虫病患者血清的结果高度一致。另外,试条法的检测时间为10min,血清用量低于10μL,且具较高的敏感度。结论以r FgCL1-YN建立的快速诊断胶体金免疫层析试条,检测巨片形吸虫病具有较高的诊断价值。

大片形吸虫CatL1蛋白的原核表达及其特异性多克隆抗体的制备

为了制备大片形吸虫诊断抗体,试验采用原核表达制备大片形吸虫组织蛋白酶L1重组蛋白(rFgCatL1),用该蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗体效价,Western-blot法检测多克隆抗体的特异性。结果表明:CatL1基因大小为981 bp,蛋白质分子质量为39.0 ku左右,与预期分子质量大小一致。制备的小鼠多克隆抗体血清效价达1∶128 000,能特异性识别大片形吸虫排泄-分泌物(ESP)抗原。说明制备的rFgCatL1多克隆抗体可作为良好的诊断抗体用于研制快速诊断试剂盒。

抑制消减杂交技术筛选大鼠急性心肌缺血后差异基因

目的采用抑制消减杂交技术,筛选早期心肌缺血相关的RNA分子,为相关研究和应用提供依据。方法 10只SD雄性大鼠结扎冠状动脉前降支1h,制作心肌缺血模型。以缺血心肌的RNA分子为实验组,以非缺血区的RNA分子为对照组,用Clontech公司抑制消减杂交试剂盒进行杂交。经蓝白斑筛选阳性克隆测序并经过斑点杂交确认,构建早期大鼠心肌缺血后抑制消减杂交文库,所得序列和Genbank数据库比对。结果筛选到10个阳性克隆和11个未知基因的表达序列标签(expressed sequence tag,EST),按照功能分类,包括代谢相关的酶类基因,核糖体和翻译相关的基因,心肌重塑相关的基因等,其中组织蛋白酶L1,basigin等基因等是首次报道与早期心肌缺血相关。结论采用抑制消减杂交技术获得的差别表达基因可为早期心肌缺血提供新的目标分子。