斜卧青霉114-2 cbh1基因的TAIL-PCR克隆及与抗阻遏突变株JU-A10的比较

【目的】研究斜卧青霉(Penicillium decumbens)114-2与其抗阻遏突变株JU-A10外切酶基因序列的差异。【方法】用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和RT-PCR扩增得到斜卧青霉114-2外切葡聚糖酶Ⅰ(cbh1)基因全长和cDNA全长。【结果】cbh1基因全长为1500bp,含有两个内含子,编码453个氨基酸(GenBank,EF397602)。克隆并分析了1.9kb的cbh1基因上游序列,分别发现了葡萄糖代谢抑制因子CREⅠ与纤维素酶转录调控蛋白ACEΙ的两个的潜在结合位点。【结论】在相同的培养条件下,其抗阻遏突变株JU-A10的外切酶活明显高于野生株114-2。两菌株的cbh1基因序列完全一致,说明外切酶活明显提高不是由于cbh1基因发生突变引起的。

启动子cbh1的改造与里氏木霉通用质粒载体的构建

里氏木霉具有优异的表达及分泌异源蛋白的能力。本研究为了提高里氏木霉在工业生产中异源蛋白表达产量,对cbh1启动子中四处葡萄糖反馈抑制位点进行突变,并且成功构建两株定点插入型表达质粒pG与pH。在后续的报告基因红色荧光蛋白DsRed表达过程中,pG比pH表现出更优异的表达能力,并且异源蛋白基因被定点插入了cbh1基因位点而对该基因进行了敲除。pG质粒具有工业应用前景。

里氏木霉表达异源中性内切纤维素酶蛋白以改善最佳酶活pH

为了提高里氏木霉中天然纤维素酶的最佳活性pH,本实验从特异腐质霉,灰腐质霉的变种,枯草芽孢杆菌LH中分别筛选并克隆了其含有的中性纤维素酶基因,将其置于里氏木霉cbh1启动子的启动下,在里氏木霉中进行异源表达。改造株在pH 6.0下酶活提升16%,pH 7.0下活性保留75%以上,而此时原始菌酶活残留20%。本实验所得的产中性纤维素酶里氏木霉基因改造株,由于其良好的中酸性活性表现,在食品,纺织,纸浆和造纸行业应也有良好的使用潜力。

糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)漆酶POXA1在里氏木霉中的高效表达及酶学性质

【目的】将优化后的糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)漆酶基因pox1,在里氏木霉中进行高效表达并对重组表达的漆酶进行酶学性质测定。【方法】:根据里氏木霉的密码子偏好性,对漆酶POXA1密码子进行优化并合成。以质粒pBluscriptⅡSK(+)为骨架,利用里氏木霉纤维二糖水解酶基因(cbh1)的启动子和终止子序列构建里氏木霉外源蛋白表达载体pSKLDT。PEG介导的原生质体转化方法转化里氏木霉菌株Tu6,筛选获得漆酶表达工程菌;通过木霉工程菌摇瓶发酵培养后对发酵液上清中的漆酶进行纯化,并对异源表达的漆酶酶学性质进行研究。【结果】经尿嘧啶缺陷培养基筛选获得木霉阳性转化子,通过PCR分析及漆酶酶活性筛选获得漆酶高效表达重组菌LC-7,该重组菌经摇瓶发酵144h后粗酶液酶活达237.134IU/mL,酶活较其出发菌Pleurotus ostreatus提高了28.6倍。酶学性质研究表明,纯酶的比活为9852IU/mg,最适温度为50℃,最适pH为3.0,最适底物为ABTS,该漆酶催化ABTS的Km和Vmax分别为7.58×10-2mmol/L及9.752×10-3mmol/L/min,金属离子Cu2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、Ba2+、Mg2+等对漆酶有不同程度的抑制作用,但Fe2+能明显的抑制漆酶的催化活性。【结论】外源漆酶基因能在里氏木霉中实现高效分泌表达。