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抗菌肽Cecropin AD在毕赤酵母中的组成型表达及中试发酵研究 被引量:4
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作者 江学斌 张敏静 +1 位作者 林健聪 梁世中 《饲料工业》 北大核心 2011年第19期25-29,共5页
构建表达抗菌肽Cecropin AD蛋白的真核重组表达质粒pGAPZα-A-CAD,并转化酵母菌Pichia pastoris X-33,Zeocin抗性筛选阳性重组子,通过PCR鉴定、Tricine-SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得抗菌肽CAD组成型表达菌株,并采用pH-溶氧监... 构建表达抗菌肽Cecropin AD蛋白的真核重组表达质粒pGAPZα-A-CAD,并转化酵母菌Pichia pastoris X-33,Zeocin抗性筛选阳性重组子,通过PCR鉴定、Tricine-SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得抗菌肽CAD组成型表达菌株,并采用pH-溶氧监控策略进行工程菌Pichia pastoris X-33/pGAPZα-A-CAD的50 L中试发酵研究。结果表明,本实验成功实现了抗菌肽CAD在毕赤酵母Pichiapastoris X-33中的组成型表达pGAPZα-A,Tricine-SDS-PAGE分析显示在4.0 kDa处有明显的目的条带,工程菌经50 L发酵罐培养48 h后收获的上清液,100℃热处理10 min后,对金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922等均有明显的抑杀作用。抗菌肽的组成型表达方法在本研究中得到了成功应用,中试研究为以后的规模化生产和应用奠定了基础。 展开更多
关键词 抗菌肽 cecropin ad 毕赤酵母 发酵 抑菌活性
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抗菌肽Cecropin AD在毕赤酵母中的组成型表达的研究 被引量:3
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作者 王珍 姜建阳 +2 位作者 祝发明 李丽 谯仕彦 《中国畜牧杂志》 CAS 北大核心 2010年第5期51-54,共4页
为了利用组成型表达方法在Pichia pastoris SMD1168中表达抗菌肽Cecropin AD,利用化学方法合成编码抗菌肽Cecropin AD的基因片段SH,将基因片段SH插入到载体pGAPZa-A中命名为pGAPZa-ASH,将pGAPZa-ASH电转至Pichia pastoris SMD1168中,Zec... 为了利用组成型表达方法在Pichia pastoris SMD1168中表达抗菌肽Cecropin AD,利用化学方法合成编码抗菌肽Cecropin AD的基因片段SH,将基因片段SH插入到载体pGAPZa-A中命名为pGAPZa-ASH,将pGAPZa-ASH电转至Pichia pastoris SMD1168中,Zecion抗性筛选阳性重组子。用Tricine-SDS-PAGE分析表达状况,琼脂扩散法检测蛋白的抑菌活性。结果表明:在3.0ku处有目的条带,并且表达产物抗菌肽Cecropin AD有生物活性。研究利用组成型表达方法在毕赤酵母菌株成功表达了抗菌肽Cecropin AD。组成型表达方法在本研究中成功的应用,为以后的实验研究奠定了理论基础。 展开更多
关键词 抗菌肽cecropin ad PICHIA PASTORIS pGAPZa-A 组成型
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Pro-apoptotic effect of cecropin AD on nasopharyngeal carcinoma cells 被引量:1
3
作者 XIAO Ye-chen HUANG Ya-dong +2 位作者 XU Pei-lin ZHOU Zhen-qing LI Xiao-kun 《Chinese Medical Journal》 SCIE CAS CSCD 2006年第12期1042-1046,共5页
Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is one of the highly prevalent malignancies in Southeast Asia. Chemotherapy and radiotherapy are commonly administrated to treat nasopharyngeal carcinoma, but these therapies can not p... Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is one of the highly prevalent malignancies in Southeast Asia. Chemotherapy and radiotherapy are commonly administrated to treat nasopharyngeal carcinoma, but these therapies can not prevent the recurrence and metastasis of tumor cells. Furthermore, these therapies have severe side effects. Therefore, it is important to find a more effective therapy, e. g., a gene therapy for treatment of nasopharyngeal carcinoma. Cecropin AD (Cad) is a hybrid peptide that exhibits higher antibacterial activity than natural cecropin. It consists of 1-11 amino acid residues in the N-end of cecropin A and 12-37 amino acid residues in the c-end of cecropin D. The role of Cad in the malignant cells remains unclear. In this study, the Cad gene was cloned and transferred into NPC CNE2 cells and its pro-apoptotic effect were investigated. 展开更多
关键词 cecropin ad nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells APOPTOSIS
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蚕抗菌肽AD-酵母制剂对粤黄鸡肠道消化酶和饲料品质的影响 被引量:24
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作者 何丹林 温刘发 +4 位作者 邓春柳 洪超 周艺恩 彭超雄 黄自然 《中国家禽》 北大核心 2004年第7期9-10,共2页
添加蚕抗菌肽AD-酵母制剂(CADYP)500g/t(活性剂量为30u/g料)以研究其对鸡小肠内容物酶活性、饲料能量和氮利用率及饲料中细菌和霉菌繁殖的影响。结果表明:CADYP,对粤黄鸡小肠内容物中淀粉酶和蛋白酶活性和饲料营养价值无不良影响;对饲... 添加蚕抗菌肽AD-酵母制剂(CADYP)500g/t(活性剂量为30u/g料)以研究其对鸡小肠内容物酶活性、饲料能量和氮利用率及饲料中细菌和霉菌繁殖的影响。结果表明:CADYP,对粤黄鸡小肠内容物中淀粉酶和蛋白酶活性和饲料营养价值无不良影响;对饲料中霉菌繁殖无抑制作用,但能有效地抑制饲料中细菌的繁殖。 展开更多
关键词 蚕抗菌肽ad-酵母制剂 粤黄鸡 肠道消化酶 营养价值 细菌 霉菌 饲料品质
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天蚕抗菌肽AD基因在AcNPV载体系统中的表达研究 被引量:15
5
作者 黄亚东 郑青 +4 位作者 李校 赵文 许华 吴晓萍 黄自然 《中国抗生素杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期304-307,313,共5页
目的 研究利用昆虫杆状病毒载体系统在昆虫培养细胞和虫体中高效表达新型多肽抗生素天蚕抗菌肽AD(cecropinAD ,CAD)。方法 采用聚合酶链反应 ( polymerasechainreaction ,PCR)点突变技术改造CAD基因 ,改造后的CAD基因先克隆到质粒 pGE... 目的 研究利用昆虫杆状病毒载体系统在昆虫培养细胞和虫体中高效表达新型多肽抗生素天蚕抗菌肽AD(cecropinAD ,CAD)。方法 采用聚合酶链反应 ( polymerasechainreaction ,PCR)点突变技术改造CAD基因 ,改造后的CAD基因先克隆到质粒 pGEM Teasyvector中进行鉴定和序列分析 ,然后再亚克隆到苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 (Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus ,AcNPV)表达载体pAcGP67B中 ,获得重组病毒载体 pAcAD。用重组病毒载体 pAcAD和野生AcNPVDNA共感染草地夜蛾 (Spodopterafrugiperdoda)Sf9细胞 ,经空斑法筛选得到重组病毒AcNPVAD。重组病毒AcNPVAD经PCR扩增鉴定 ,证实了CAD基因已经整合到重组病毒AcNPVAD中。结果 以AcNPVAD转染Sf9细胞和苜蓿丫纹夜蛾幼虫 ,抑菌活性试验证实CAD基因在昆虫培养细胞Sf9和苜蓿丫纹夜蛾幼虫虫体中均得到表达 ,表达产物具有抑菌作用。通过离子交换层析 ,杂蛋白基本去除 ,重组抗菌肽获得初步纯化 ,重组抗菌肽活性峰位于 0 75mol/L处。结论 CAD基因在昆虫杆状病毒载体系统获得了表达 ,表达产物具有抑菌活性。 展开更多
关键词 多肽抗生素 天蚕抗菌肽(ad) 多角体病毒(AcNPV) 基因表达
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昆虫抗真菌肽Thanatin-CAD双价基因的合成、克隆及其表达 被引量:8
6
作者 黄亚东 曾锦绣 +4 位作者 温硕洋 王艳 李校坤 钟仰进 曹阳 《蚕业科学》 CAS CSCD 2003年第2期162-166,共5页
为促进昆虫抗菌肽基因在转基因抗病育种和生物工程制药的应用,通过设计嵌合引物结合分段PCR的方法将抗真菌肽Thanatin基因与Cecropin AD基因(CAD基因)融合拼接为Thanatin-CAD双价基因,采用T-A克隆法将其克隆至pGEM-T Easy载体,进行测序... 为促进昆虫抗菌肽基因在转基因抗病育种和生物工程制药的应用,通过设计嵌合引物结合分段PCR的方法将抗真菌肽Thanatin基因与Cecropin AD基因(CAD基因)融合拼接为Thanatin-CAD双价基因,采用T-A克隆法将其克隆至pGEM-T Easy载体,进行测序,结果证实与预期设计的完全一致;然后再将其亚克隆至表达载体pET-21d中,用IPTG诱导含重组表达质粒的菌株,对表达产物进行生物活性测定,初步结果显示Thanatin-CAD双价基因的融合表达产物对受试细菌无抑菌活性,但对部分病原真菌有较强的抑菌作用。 展开更多
关键词 昆虫抗真菌肽 Thanatin-Cad双价基因 基因合成 基因克隆 融合基因 基因表达 病原真菌 抑菌作用
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天蚕素AD和蛙Buforin Ⅱ融合蛋白在大肠杆菌中的表达 被引量:4
7
作者 扈进冬 魏艳丽 +2 位作者 张广志 李纪顺 杨合同 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第4期35-38,共4页
本试验采用改良二步全基因合成法人工合成了含大肠杆菌偏爱密码子的天蚕素AD和蛙BuforinⅡ成熟片段的融合基因,并克隆至pMD18-T中,经测序确认正确后,与pET-Trx连接,构建了表达载体pET-Trx-CAD-BuforinⅡ,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表... 本试验采用改良二步全基因合成法人工合成了含大肠杆菌偏爱密码子的天蚕素AD和蛙BuforinⅡ成熟片段的融合基因,并克隆至pMD18-T中,经测序确认正确后,与pET-Trx连接,构建了表达载体pET-Trx-CAD-BuforinⅡ,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。表达产物占菌体总蛋白的35%,经羟胺裂解后对测试菌具有较好的杀菌效果,为进一步的开发与应用打下了基础。 展开更多
关键词 基因合成 Cad BuforinⅡ 载体构建
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改造后的抗菌肽AD基因在毕赤酵母中表达效价研究 被引量:3
8
作者 赵亚华 徐伟 +3 位作者 蔡家伟 胡康 廖富蘋 黄自然 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 2003年第8期77-82,共6页
通过PCR方法使抗菌肽AD基因中带有XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点序列 ,再克隆到表达载体pPICZα A中 ,重组表达载体转化GS1 1 5 ,经重组酵母菌表达的抗菌肽AD ,其N端去除了其它氨基酸。对重组抗菌肽培养条件进行优化 ,在YEPD中含葡萄糖 2 % ,pH... 通过PCR方法使抗菌肽AD基因中带有XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点序列 ,再克隆到表达载体pPICZα A中 ,重组表达载体转化GS1 1 5 ,经重组酵母菌表达的抗菌肽AD ,其N端去除了其它氨基酸。对重组抗菌肽培养条件进行优化 ,在YEPD中含葡萄糖 2 % ,pH为 7 5 ,重组酵母菌培养 30h后 ,0 5 %甲醇诱导 42h ,杀菌效价达 1 843,是改造前的 3 1倍。最后重组抗菌肽经CM cellulose2 3柱层析得到纯化。 展开更多
关键词 抗菌肽ad基因 毕赤酵母 表达效价 表达载体
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一种新型天蚕素杂合肽AD和aFGF突变体融合蛋白S的构建及表达 被引量:3
9
作者 苏志坚 吴晓萍 +4 位作者 郑青 黄亚东 庞实锋 冯雅 李校堃 《暨南大学学报(自然科学与医学版)》 CAS CSCD 2004年第4期420-425,共6页
目的 :构建和表达一种带有凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽AD和人酸性成纤维细胞生长因子 (acidicfibroblastgrowthfactor ,aFGF)突变体的融合蛋白S ,在创伤皮肤表面应用时能自动裂解成有抗感染功能的天蚕素杂合肽AD和皮肤修复功能的aFGF... 目的 :构建和表达一种带有凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽AD和人酸性成纤维细胞生长因子 (acidicfibroblastgrowthfactor ,aFGF)突变体的融合蛋白S ,在创伤皮肤表面应用时能自动裂解成有抗感染功能的天蚕素杂合肽AD和皮肤修复功能的aFGF突变体。方法 :利用PCR技术分别扩增出带有凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽AD基因和aFGF突变体基因。再利用两者作为模板 ,用PCR方法扩增出编码融合蛋白S的DNA。将该DNA片段插入到载体pPICZαA中 ,并利用电转法将质粒转入毕赤酵母smd116 8中 ,Zeocin抗性筛选重组转化子。甲醇诱导 72h ,SDS -PAGE电泳检测融合蛋白S的表达 ,并用Western -blot杂交检测融合蛋白S的免疫原性。结果 :筛选出的重组转化株在甲醇诱导后能表达相对分子质量约为 190 0 0的融合蛋白S ,而该蛋白能与aFGF抗体产生免疫反应。结论 :用PCR方法获得编码含凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽AD和aFGF突变体的融合蛋白SDNA 。 展开更多
关键词 天蚕素杂合肽ad aFGF突变体 融合蛋白S
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重组大肠杆菌利用乳糖自诱导系统融合表达天蚕素AD和蛙BuforinⅡ 被引量:1
10
作者 陈泉 扈进冬 +3 位作者 李哲 郭凯 李纪顺 杨合同 《科学技术与工程》 北大核心 2014年第4期179-182,共4页
以包含质粒pET-Trx-CAD-BuforinⅡ的大肠杆菌BL21(DE3)为研究对象,开发了一种利用乳糖自诱导方式表达天蚕素AD和蛙BuforinⅡ的表达系统。首先,在LB培养基中研究了乳糖浓度、诱导时机和诱导时间对目的蛋白表达的影响。然后,利用"分... 以包含质粒pET-Trx-CAD-BuforinⅡ的大肠杆菌BL21(DE3)为研究对象,开发了一种利用乳糖自诱导方式表达天蚕素AD和蛙BuforinⅡ的表达系统。首先,在LB培养基中研究了乳糖浓度、诱导时机和诱导时间对目的蛋白表达的影响。然后,利用"分解代谢物阻遏"原理构建乳糖自诱导表达系统,以"葡萄糖+主碳源"两种碳源的依次代谢将蛋白表达过程分为两个阶段:第一阶段为菌体生长阶段,菌体利用葡萄糖生长,乳糖无法进入细胞诱导蛋白表达;第二阶段为蛋白表达阶段,葡萄糖耗尽,菌体开始利用主碳源生长;同时乳糖进入细胞诱导蛋白表达。最后,利用优选的"葡萄糖+木糖"组合自诱导表达天蚕素AD和BuforinⅡ的融合蛋白,得到的目的蛋白占全菌总蛋白含量的45.2%。 展开更多
关键词 大肠杆菌 乳糖 自诱导 天蚕素ad BuforinⅡ 融合表达
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天蚕素AD和BuforinⅡ表达载体的改良和融合蛋白表达条件优化 被引量:1
11
作者 陈泉 扈进冬 +3 位作者 赵晓燕 李哲 李纪顺 杨合同 《福建农业学报》 CAS 2013年第12期1195-1199,共5页
为提高重组大肠杆菌表达天蚕素AD和BuforinⅡ融合蛋白的表达效率,研究表达菌株、质粒稳定性和诱导条件对天蚕素AD和BuforinⅡ融合蛋白表达的影响。通过SDS-PAGE分析目的蛋白占全菌总蛋白的含量,确定大肠杆菌BER2566为表达菌株;利用基因... 为提高重组大肠杆菌表达天蚕素AD和BuforinⅡ融合蛋白的表达效率,研究表达菌株、质粒稳定性和诱导条件对天蚕素AD和BuforinⅡ融合蛋白表达的影响。通过SDS-PAGE分析目的蛋白占全菌总蛋白的含量,确定大肠杆菌BER2566为表达菌株;利用基因工程技术,构建卡那霉素抗性的表达质粒pET(K)-Trx-CADBuforinII,提高质粒稳定性和蛋白表达效率;优化了IPTG浓度、诱导时机和诱导时间等诱导条件,确定菌体浓度为OD600=0.8时,IPTG浓度为0.8mmol·L-1,诱导时间为5h,目的蛋白表达量最高,可达到全菌总蛋白含量的50%以上。 展开更多
关键词 大肠杆菌 蛋白表达
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转天蚕素AD(CAD)基因于紫花苜蓿的研究
12
作者 刘秀明 朱海林 +3 位作者 杜淑环 万秋 李海燕 李校堃 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期498-502,共5页
为了探索利用紫花苜蓿Medicago sativa作为生物反应器生产杂合抗菌肽天蚕素AD(Cecropin AD,CAD)的可行性,通过PCR搭桥方法合成了CAD全长基因,并插入对外源基因表达有一定促进作用的调控元件:Ω序列、Kozak序列及KDEL四肽序列,然后将改... 为了探索利用紫花苜蓿Medicago sativa作为生物反应器生产杂合抗菌肽天蚕素AD(Cecropin AD,CAD)的可行性,通过PCR搭桥方法合成了CAD全长基因,并插入对外源基因表达有一定促进作用的调控元件:Ω序列、Kozak序列及KDEL四肽序列,然后将改造后的CAD基因克隆进载体pCAMBIA1390R,构建了pCAMBIA1390R-CAD植物表达载体.将重组质粒转入根癌农杆菌Agrobacterium tumefacienLBA4404,并通过农杆菌介导方法将CAD基因转化入紫花苜蓿.在含潮霉素(20 mg/L)的筛选培养基上筛选转基因植株,通过PCR、Southern blotting检测,CAD基因已经转入紫花苜蓿中;提取蛋白质进行抑菌活性研究,结果表明转基因苜蓿蛋白提取物对沙门氏菌Sal-monella及金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus具有一定抑菌活性. 展开更多
关键词 紫花苜蓿 抗菌肽 天蚕素ad 转基因
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抗菌肽在肉鸭生产中应用剂量的研究 被引量:11
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作者 缪小群 陈晓生 +3 位作者 赵宇飞 陈志华 张福英 温刘发 《中国家禽》 北大核心 2006年第11期24-26,共3页
日粮中按3、6、12L的量使用蚕抗菌肽AD制剂,结果表明:三种剂量下,肉鸭增重效果均优于金霉素并且差异显著(P<0.05);当用量大于3L时,增重和49日龄屠宰率有下降趋势,到12L时,小鸭阶段增重、49日龄屠宰率比使用3、6L时有显著降低(P<0.... 日粮中按3、6、12L的量使用蚕抗菌肽AD制剂,结果表明:三种剂量下,肉鸭增重效果均优于金霉素并且差异显著(P<0.05);当用量大于3L时,增重和49日龄屠宰率有下降趋势,到12L时,小鸭阶段增重、49日龄屠宰率比使用3、6L时有显著降低(P<0.05);与使用金霉素比较,料重比、净肉率和全净膛率在各阶段均无显著差异(P>0.05)。肉鸭促生长的理想剂量为每吨日粮3L抗菌肽制剂。 展开更多
关键词 蚕抗菌肽ad制剂 肉鸭 生产性能
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新城疫载体系统表达天蚕素AD抗菌肽及其抑菌效果 被引量:1
14
作者 任项霏 冯贺龙 +11 位作者 徐英英 李丽 杨宏春 王鑫 商雨 阳柳君 周祖涛 李自力 刘梅 罗青平 胡思顺 温国元 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期1820-1827,共8页
为探究天蚕素AD抗菌肽是否能在新城疫病毒(NDV)载体系统中表达,且通过该种表达系统得到的CAD是否有生物活性。采用同源重组的方式将CAD插入至NDV载体pTS09-C中,并利用反向遗传操作系统成功拯救出重组病毒rTS-CAD,该重组病毒能在SPF鸡胚... 为探究天蚕素AD抗菌肽是否能在新城疫病毒(NDV)载体系统中表达,且通过该种表达系统得到的CAD是否有生物活性。采用同源重组的方式将CAD插入至NDV载体pTS09-C中,并利用反向遗传操作系统成功拯救出重组病毒rTS-CAD,该重组病毒能在SPF鸡胚中稳定增殖。通过生物学特性分析,在NDV TS09-C株的P和M基因之间插入CAD基因并未改变其的弱毒和增殖特性。间接免疫荧光试验证实重组病毒能在BHK-21细胞中稳定表达CAD抗菌肽。抑菌试验结果显示,NDV载体系统表达的CAD对金黄色葡萄球菌(G+)和大肠杆菌(G-)均有一定的抑制作用:在微孔板法抑菌试验中,重组病毒表达的CAD抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑制率为79.6%~91.7%,对大肠杆菌的抑制率为87.5%~89.8%;在与DF-1细胞共培养试验中,重组病毒表达的CAD抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑制率可以达到74.5%~77.7%,对大肠杆菌的抑制率为35.0%~45.0%。本研究表明,NDV载体系统能够成功表达出有活性的CAD抗菌肽,且有良好的抑菌效果。这一研究为探索NDV载体表达抗菌肽和进一步研究CAD的局部效应奠定了一定的理论基础。 展开更多
关键词 天蚕素ad 新城疫病毒载体 反向遗传操作系统 抗菌肽
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重组柞蚕抗菌肽AD的纯化及鉴定 被引量:1
15
作者 耿艺介 张倩 +5 位作者 王兴顺 李浩 杨小柯 李迎慧 黄自然 邓平建 《中国热带医学》 CAS 2015年第1期15-18,共4页
目的从重组柞蚕抗菌肽AD毕赤酵母发酵液中分离纯化出抗菌肽纯品,并对其进行纯度、分子量和抗菌作用的鉴定。方法用离子交换和疏水层析法对发酵液中的重组柞蚕抗菌肽AD进行分离纯化,用高效液相色谱法分析产物的纯度,再用基质辅助激光解... 目的从重组柞蚕抗菌肽AD毕赤酵母发酵液中分离纯化出抗菌肽纯品,并对其进行纯度、分子量和抗菌作用的鉴定。方法用离子交换和疏水层析法对发酵液中的重组柞蚕抗菌肽AD进行分离纯化,用高效液相色谱法分析产物的纯度,再用基质辅助激光解析—飞行时间质谱仪对产物进行分子量鉴定,并结合传统微量肉汤稀释法和流式细胞术分析重组柞蚕抗菌肽AD纯品对E.coli敏感株及耐药株的抗菌作用。结果重组柞蚕抗菌肽AD经离子交换和疏水层析纯化后的纯度达到98.40%,分子量为4068.15Da,与所设计的重组柞蚕抗菌肽AD大小相近。所纯化出的重组柞蚕抗菌肽AD对E.coli的敏感株ATCC25922和产β-内酰胺酶耐药株株ATCC35218的抗菌作用均为MIC 8μg/m L,而头孢他啶和氨苄西林对耐药株ATCC35218的MIC的值分别为8μg/m L和>32μg/m L。结论成功纯化分离出具有自主知识产权的重组柞蚕抗菌肽AD,其对E.coli敏感株和耐药株具有相同的抗菌效果。 展开更多
关键词 抗菌肽ad 高效液相色谱 基质辅助激光解析—飞行时间质谱 流式细胞术
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天蚕素AD在毕赤酵母中的多拷贝整合表达及表达条件优化 被引量:1
16
作者 牛军波 薛林贵 +5 位作者 吴娟丽 陈熙明 李娟 王霞 刘阳 Emaneghemi Brown 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期1441-1451,共11页
【背景】天蚕素抗菌肽是目前研究最清楚、效果最显著的抗菌肽,实现工业化生产为其在农业、养殖业中的应用奠定了基础。【目的】获得一株高效生产天蚕素AD的基因工程菌株。【方法】构建重组载体pGAPZαA-CAD通过电击转化至Pichiapastoris... 【背景】天蚕素抗菌肽是目前研究最清楚、效果最显著的抗菌肽,实现工业化生产为其在农业、养殖业中的应用奠定了基础。【目的】获得一株高效生产天蚕素AD的基因工程菌株。【方法】构建重组载体pGAPZαA-CAD通过电击转化至PichiapastorisX33中,表达天蚕素AD基因并获得X33/GCAD菌株;构建重组载体pUCGAP-CAD导入至X33/GCAD菌株中。pGAPZαA-CAD是以博来霉素为抗性筛选标签被整合到P.pastoris X33的GAPDH启动子区域,pUCGAP-CAD是以遗传霉素为抗性筛选标签被整合到P.pastoris X33的非翻译rDNA区域,最终获得一株高效表达天蚕素AD的酵母菌株X33/GUCAD。【结果】通过质谱分析鉴定X33/GUCAD表达的抑菌物质为天蚕素AD,通过发酵条件的优化,表明X33/GUCAD菌株在以甘油为碳源和以蛋白胨、酵母提取物为有机氮源的情况下具有较强表达天蚕素AD的能力。【结论】较高的拷贝数更有利于提高天蚕素AD的产量,此工程菌株在后期发酵过程中稳定性较好,适于工业化生产。 展开更多
关键词 天蚕素ad 基因工程菌 生物效价
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内含肽介导的天蚕素AD基因工程表达、其酰胺化及应用 被引量:3
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作者 周冠 李蕾 +2 位作者 邓玮 李希平 俞超 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2016年第8期705-709,共5页
目的设计、合成天蚕素AD(CAD)基因序列,与内含肽(Intein)融合表达后通过重组蛋白自剪切作用获得C端酰胺化的CAD,并与抗生素配伍使用。方法根据大肠埃希菌密码子偏好性对CAD基因序列进行改造,人工合成目的基因,构建重组质粒pCold-SUMO-CA... 目的设计、合成天蚕素AD(CAD)基因序列,与内含肽(Intein)融合表达后通过重组蛋白自剪切作用获得C端酰胺化的CAD,并与抗生素配伍使用。方法根据大肠埃希菌密码子偏好性对CAD基因序列进行改造,人工合成目的基因,构建重组质粒pCold-SUMO-CAD-Intein,转化大肠埃希菌,诱导表达重组蛋白,经镍柱亲和层析纯化,后用DTT及肠激酶切割,利用分子筛纯化获得酰胺化CAD,并进行电泳及质谱鉴定。采用微量肉汤法检测重组CAD抑菌活性及其与不同抗生素按不同比例配伍使用的抑菌活性。结果 PCR扩增目的基因片段为132bp,与预期一致。质谱显示表达的CAD分子质量单位为3.949ku,与理论值相符。所得CAD抗菌肽对常见革兰阴性菌抗菌力强,配伍抗生素使用能发挥协同抑菌作用。结论成功构建CAD基因重组质粒pCold-SUMO-CAD-Intein,通过与内含肽(Intein)融合表达,经分子内的自剪切作用直接获得C末端酰胺化的抗菌肽,与抗生素配伍使用,能显著降低抗生素用量,具有作为抗生素替代物的应用潜力。 展开更多
关键词 天蚕素ad 表达 酰胺化 抗生素 配伍
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