长链非编码RNALINC00184调控老年高血压血管内皮细胞的增殖与迁移

目的高血压是老年人动脉粥样硬化发生和发展的重要致病因素。血管内皮细胞的损伤和衰老加速动脉粥样硬化的发生和发展。作为基因转录和翻译的重要调控元件,长链非编码RNA(lncRNA)已经被证实在多种生物学过程中发挥重要作用,但其在高血压引起动脉粥样硬化以及血管内皮损伤中的作用和分子机制远未了解清楚。方法回顾性收集上海交通大学医学院附属仁济医院2019年5月—2020年12月老年医学科门诊具备完整病史资料的老年患者(≥60岁)共51例,根据血压及颈动脉内膜中层厚度(CIMT)分为3组:高血压伴动脉粥样硬化组、高血压不伴动脉粥样硬化组和无高血压的动脉粥样硬化组。通过荧光定量PCR检测高血压以及高血压伴动脉粥样硬化患者血液中的lncRNA的表达。在人血管内皮细胞中,通过转染siRNA的方式敲减LINC00184,通过免疫荧光等形态学方法检测内皮细胞的增殖与迁移是否受到影响。利用荧光素酶报告基因、免疫印迹等方法,明确LINC00184参与调控血管内皮细胞的作用机制。结果3组间的CIMT、收缩压和舒张压有显著差异(P<0.05);LINC00184在老年高血压患者的血浆中高表达;LINC00184在人血管内皮细胞中高表达,且主要分布于细胞质中;敲减LINC00184导致血管内皮细胞增殖和迁移能力增强;LINC00184通过影响miR-17调控PTEN的表达参与血管内皮细胞的功能。结论老年高血压相关LINC00184参与调控血管内皮细胞的增殖和迁移,为进一步探究高血压导致的靶器官损伤的分子机制提供理论依据。

LINC01410促进食管鳞状细胞癌细胞增殖和迁移的作用及其机制研究

背景与目的:LINC01410是长度为647 bp的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA),其异常表达参与多种肿瘤的发生、发展,但其对食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的影响研究较少。本研究旨在探讨LINC01410促进ESCC细胞增殖和迁移的作用机制,以期为防治ESCC提供生物标志物及潜在治疗靶点。方法:应用基因表达谱交互分析2(Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2,GEPIA2)在线分析LINC01410在肿瘤与癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)ESCC数据中的表达水平及与患者预后总生存期的关系;采用基因探针富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)LINC01410可能调控的信号转导通路。收集2020年1月—2021年12月在新乡医学院第一附属医院、平顶山市第一人民医院胸外科行根治性手术的ESCC患者新鲜肿瘤组织标本62例,并选取癌旁组织作为对照。本项目经医院伦理委员会批准(新乡医学院第一附属医院,编号:2018036;平顶山市第一人民医院,编号:2019-018)。本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)检测LINC01410的表达水平并分析其与临床病理学参数的关系。应用LV-NC、LV-over/LINC01410转染EC109细胞并建立稳定过表达细胞株EC109/NC、EC109/OE,采用shRNA-NC、shRNA-LINC01410转染EC9706细胞并建立稳定敲降细胞株EC9706/NC、EC9706/KD;应用RTFQ-PCR检测LINC01410的相对表达量;采用噻唑蓝比色法[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]实验和克隆形成实验检测细胞增殖;采用transwell实验检测细胞迁移能力;采用双荧光素酶报告基因实验检测LINC01410对T细胞因子/淋巴增强因子1(T cell factor/lymphoid enhancer factor 1,TCF/LEF1)启动子活性的影响;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号转导通路、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)信号转导通路相关蛋白表达水平。结果:GEPIA2分析显示,在ESCC组织中LINC01410表达水平显著高于食管正常组织,两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。生存分析显示,高表达LINC01410的ESCC患者生存率显著低于低表达LINC01410的患者(P=0.042)。RTFQ-PCR检测结果显示,在ESCC组织中LINC01410表达水平显著高于配对癌旁组织;LINC01410高表达与肿瘤浸润程度、淋巴结转移及TNM分期显著相关(P<0.01);与食管正常上皮细胞HEEC相比,LINC01410在EC109、EC9706细胞中显著高表达(P<0.05);LINC01410在EC109/OE细胞中显著高表达(P<0.01),而在EC9706/KD细胞中显著下调(P<0.01)。MTT结果显示,EC109/OE细胞48 h时细胞活性显著高于EC109/NC细胞(P<0.01);EC9706/KD细胞48 h时细胞活性显著低于EC9706/NC(P<0.01)。细胞克隆形成实验结果显示,与EC109/NC细胞相比,EC109/OE细胞克隆数显著增多;与EC9706/NC细胞相比,EC9706/KD细胞克隆数明显减少(P<0.01)。Transwell迁移实验结果显示,EC109/OE细胞株迁移的细胞数显著多于EC109/NC细胞(P<0.01),而EC9706/KD细胞迁移的细胞数显著少于EC9706/NC细胞(P<0.01)。GSEA分析显示,Wnt/β-catenin、EMT等信号转导通路显著富集在高表达LINC01410的ESCC组织中。双荧光素酶报告基因实验结果示,EC109/OE细胞中TCF/LEF1启动子活性显著高于EC109/NC细胞,EC9706/KD细胞中TCF/LEF1启动子活性显著低于EC9706/NC细胞(P<0.01)。Western blot检测结果显示,与EC109/NC细胞相比,EC109/OE细胞中E-cadherin蛋白表达下调,而N-cadherin、β-cantenin、cyclin D1、c-Myc等蛋白显著上调;与EC9706/NC细胞相比,E-cadherin蛋白表达上调,而N-cadherin、β-cantenin、cyclin D1、c-Myc等蛋白显著下调。结论:LINC01410具有促进ESCC细胞增殖和迁移的作用,其机制可能与激活EMT、Wnt/β-catenin等信号转导通路有关。

非小细胞肺癌组织中lncRNA GAS5、LHPP表达与上皮间质化相关性及临床意义

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者癌组织中长链非编码核糖核酸生长抑制特异性基因5(lncRNA GAS5)、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸盐磷酸酶(LHPP)表达与上皮间质化(EMT)相关性及临床意义。方法收集2018年6月至2020年1月在河北北方学院附属第一医院行手术切除的NSCLC 90例患者的癌组织及癌旁组织,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测lncRNA GAS5、LHPP和EMT相关蛋白[E-钙黏蛋白(E-Cad)、N-钙黏蛋白(N-Cad)和波形蛋白(VIM)]表达。分析NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5、LHPP mRNA与临床病理特征的关系,并通过Pearson相关性分析NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5、LHPP mRNA与EMT相关蛋白表达的相关性。采用Kaplan-Meier法绘制不同lncRNA GAS5、LHPP mRNA表达的NSCLC患者生存曲线,多因素Cox回归分析NSCLC患者预后的影响因素。结果NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5、LHPP mRNA、E-Cad mRNA表达低于癌旁组织,N-Cad mRNA、VIM mRNA表达高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关性分析显示,NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5与E-Cad mRNA表达呈正相关(r=0.724,P<0.001),与N-Cad mRNA、VIM mRNA表达呈负相关(r=-0.699、-0.689,P<0.001);lncRNA GAS5与LHPP mRNA表达呈正相关(r=0.651,P<0.001)。不同分化程度、肿瘤TNM分期、淋巴结转移的NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5、LHPP mRNA表达比较差异有统计学意义(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示,lncRNA GAS5高表达组的3年总生存率[68.18%(30/44)]高于lncRNA GAS5低表达组的3年总生存率[36.96%(17/46)];LHPP mRNA高表达组的3年总生存率[67.39%(31/46)]高于LHPP mRNA低表达组的3年总生存率[36.36%(16/44)],差异有统计学意义(χ^(2)=10.274、10.322,P<0.05)。低分化、肿瘤TNM分期Ⅲ期、有淋巴结转移为NSCLC患者死亡的独立危险因素,lncRNA GAS5≥1.32、LHPP mRNA≥1.12为独立保护因素(P<0.05)。结论NSCLC患者癌组织中lncRNA GAS5、LHPP mRNA低表达,与EMT相关蛋白表达、分化程度、肿瘤TNM分期、淋巴结转移和预后有关,可能成为NSCLC诊治的新靶点。

lncR FOXD2-AS1调控miR-145-5p对非小细胞肺癌细胞生物学特性的影响

目的 探讨长链非编码RNA(lncR)FOXD2-AS1调控微小RNA(miR)-145-5p对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化(EMT)等生物学特性的影响。方法 体外培养人NSCLC细胞系A549、H1299、SK-MES-1及人正常肺支气管上皮细胞系16HBE,应用RT-qPCR检测各细胞系中lncR-FOXD2-AS1和miR-145-5p表达。选取lncR-FOXD2-AS1相对高表达的SK-MES-1作为敲低实验的研究对象,将SK-MES-1细胞按照转染处理的不同分为NC组(转染si-NC)和si-FOXD2-AS1组(转染si-FOXD2-AS1),转染后,RT-qPCR检测细胞中lncR-FOXD2-AS1、miR-145-5p表达,CCK-8法检测细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力,Western blotting法检测细胞中E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证lncR-FOXD2-AS1和miR-145-5p的相互关系。结果 与16HBE细胞相比,lncR-FOXD2-AS1在NSCLC细胞系中高表达(P<0.05),miR-145-5p在NSCLC细胞系中低表达(P均<0.05)。与NC组比较,si-FOXD2-AS1组细胞miR-145-5p表达升高(P<0.05),0、24、48 h时OD值降低(P均<0.05),迁移及侵袭穿膜细胞数减少(P均<0.05),E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05),N-cadherin、Fibronectin蛋白表达降低(P均<0.05)。双荧光素酶实验证实miR-145-5p是lncR-FOXD2-AS1的靶基因。结论 lncR-FOXD2-AS1在NSCLC细胞系中表达升高,敲低lncR-FOXD2-AS1通过靶向调控miR-145-5p抑制NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT进程。

脐带间充质干细胞外泌体LncRNA H19修复软骨损伤的机制

背景:脐带间充质干细胞已被证明对软骨损伤有治疗作用,外泌体是脐带间充质干细胞在体内发挥治疗作用的主要载体。课题组前期发现LncRNA H19是介导脐带间充质干细胞外泌体调控软骨细胞活性的重要活性分子,LncRNA H19可以吸附miR-29b-3p从而促进软骨细胞的增殖再生,但是其下游机制仍未清楚。目的:从外泌体和LncRNAs角度揭示脐带间充质干细胞治疗软骨损伤的具体机制,为软骨损伤的治疗提供新的靶点。方法:构建稳定过表达LncRNA H19的脐带间充质干细胞,采用超速离心提取外泌体(H19-Exos);采用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、Western blot和外泌体摄取实验鉴定外泌体;通过Western blot、qPCR和双荧光素酶报告基因系统检测miR-29b-3p过表达和沉默对TGF-β1/Smad3通路的影响;通过特异性TGF-β1/Smad3抑制剂在体内外反向验证H19-Exos对软骨再生的生物学作用。结果与结论:①H19-Exos在电镜下为典型的杯状,粒径在130 nm左右,均表达CD63、CD81和TSG1010特性蛋白;②过表达miR-29b-3p可以同时下调TGF-β1、Smad3的mRNA和蛋白水平,而沉默miR-29b-3p后,TGF-β1、Smad3的mRNA和蛋白水平上调;③双荧光素酶报告基因系统检测发现miR-29b-3p对下游靶基因TGF-β1和Smad3活性影响有显著差异;④膝关节腔内注射Ⅱ型胶原酶成功建立大鼠骨关节炎模型,H19-Exos可显著促进软骨再生,且特异性TGF-β1/Smad3抑制剂SB-431542在体内外均可阻断H19-Exos对软骨再生的生物学作用;⑤该研究系统论证了高表达LncRNA H19脐带间充质干细胞来源外泌体对软骨再生的促进作用,具体机制为LncRNA H19通过靶向miR-29b-3p/TGF-β1/Smad3通路促进软骨再生。

降低lncRNA-RMRP表达抑制人肺癌细胞系A549的增殖和侵袭

目的探讨抑制线粒体RNA加工核糖核酸内切酶RNA组分(RMRP)表达对人肺癌细胞系A549增殖和侵袭的影响;检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者全血和组织中RMRP表达,比较在不同临床指标表达差异性,以期为NSCLC机制研究提供参考资料。方法收集2016年3月至2021年3年在焦作市人民医院行手术治疗的NSCLC患者122例,同期,在体检中心选取健康者50名作为对照组。RT-qPCR检测全血和组织中RMRP mRNA水平。培养A549细胞分为si-RMRP组、siRNA-NC组和空白组(blank组)。RT-qPCR、CCK-8法和Transwell小室法分别检测细胞中RMRP表达、增殖活性和侵袭细胞数。结果NSCLC患者全血中RMRP相对表达量显著高于对照组(P<0.001);NSCLC组织中RMRP相对表达量高于癌旁组织(P<0.001);低分化、淋巴结转移和TNM分期Ⅲ的NSCLC患者全血和组织中RMRP相对表达量较高分化、未发生淋巴结转化和TNM分期Ⅰ~Ⅱ明显升高(P<0.05);Si-RMRP组细胞中RMRP相对表达量低于空白组(blank组)和siRNA-NC组(P<0.001);相比与blank组和siRNA-NC组,24、48、72和96 h时si-RMRP组细胞吸光度(A)值均降低(P<0.05);Si-RMRP组细胞侵袭数低于blank组和siRNA-NC组(P<0.001)。结论NSCLC患者全血和组织中RMRP相对表达量升高,下调A549细胞中RMRP基因表达可抑制细胞增殖,减少细胞侵袭。

长链非编码RNA在膀胱癌干细胞中的研究现状及展望

膀胱癌是泌尿系统常见恶性肿瘤之一,具有高发病率和死亡率,且治疗后易出现复发和转移。越来越多的证据表明,具有启动和维持肿瘤生长的肿瘤干细胞是膀胱癌治疗失败的主要原因,所以,靶向膀胱癌干细胞的治疗方式成为了目前研究重点。研究发现长链非编码RNA(lncRNA)是膀胱癌干细胞的关键调节因子,多种lncRNA参与癌症干性。这些lncRNA可以调节干细胞相关转录因子在膀胱癌中的表达。其在膀胱癌的发生和进展中发挥重要作用,目前已经被研究为抗癌治疗的靶标。为此本文对不同lncRNA在分子水平上如何调控膀胱癌干细胞特性进行综述,为未来膀胱癌的临床治疗提供理论依据及可行方向。

间充质干细胞对糖尿病肾病小鼠lncRNA的干预及肾脏保护的可能机制

目的 筛选糖尿病肾病(DN)小鼠模型中异常表达的长链非编码RNA(lncRNA),探索与间充质干细胞(MSC)干预可能的lncRNA是否对小鼠肾脏起保护作用及可能机制。方法 利用基因表达综合数据库(GEO)来源的转录组测序(RNAseq)数据,对DN小鼠RNAseq数据与正常小鼠进行筛选,得到与DN相关的lncRNA并进行验证,得到上调前3名的lncRNA,选取变化最显著的lncRNA进行下一步实验。分离培养小鼠肾小管上皮细胞(mRTECs)及骨髓间充质干细胞(BMSC),分组培养mRTECs[对照组、高糖(HG)组、HG+BMSC组],四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测各组mRTECs细胞增殖率,荧光定量PCR法检测各组mRTECs中胶原蛋白(collagen)Ⅰ、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)、波形蛋白(vimentin)、E-钙黏蛋白(cadherin) mRNA表达。采用siRNA敲减mRTECs中lncRNA的表达,构建正确的pcDNA3.1(+)质粒扩大培养。分组培养mRTECs(对照组、NC组、lncRNA组;si-NC组、si-lncRNA组、HG组、HG+si-lncRNA组;HG+BMSC组、HG+BMSC+lncRNA组),Western印迹检测各组细胞中collagenⅠ、α-SMA、vimentin、E-cadherin蛋白表达。结果 上调前3位的lncRNA为lncRNA NONMMUG023935、lncRNA NONMMUG030287、lncRNA NONMMUG004302。mRTECS经HG处理后,细胞增殖率、collagenⅠ、α-SMA和vimentin及lncRNA NONMMUG023935、lncRNA NONMMUG030287、lncRNA NONMMUG004302表达显著上升,E-cadherin表达显著下降(P<0.05)。而加入BMSC的mRTECs经HG处理后,上述指标的结果相反(P<0.05)。根据上述3个lncRNA表达变化绝对值最大选取lncRNA NONMMUG023935进行后续实验。转染si-lncRNA-NONMMUG023935后,相对应的lncRNA-NONMMUG023935表达显著降低(P<0.01)。lncRNA NONMMUG023935过表达可促进对mRTECs的损伤(P<0.05),BMSC可通过下调lncRNA NONMMUG023935表达从而抑制对HG诱导的mRTECs的损伤(P<0.05)。结论 MSC可下调DN肾小管上皮细胞中lncRNA NONMMUG023935的表达,从而改善肾脏纤维化,这可能是MSC延缓DN进展的机制之一。

lncRNA JPX对鼻咽癌细胞增殖、侵袭能力的调控作用及其机制

目的观察长链非编码RNA(lncRNA)JPX对鼻咽癌细胞增殖、侵袭能力的调控作用并探讨其机制。方法取鼻咽癌细胞系CNE-1、5-8F、6-10B、HONE-1、C666-1及鼻咽正常上皮细胞系NP69,采用RT-qPCR法检测细胞中lncRNA JPX表达,取lncRNA JPX表达最高的C666-1细胞作为研究细胞。C666-1细胞随机分为JPX降表达组、降表达对照组、JPX高表达组、高表达对照组,分别转染JPX沉默序列sh-JPX、阴性对照序列sh-NC及JPX过表达质粒pcDNA3.1-JPX、阴性对照质粒pcDNA 3.1-NC。采用MTT法观察细胞增殖能力,Transwell实验观察细胞侵袭能力。利用StarBase数据库对lncRNA JPX进行靶向miRNA及基因的预测,发现lncRNA JPX与miR-1265存在靶向结合位点、miR-1265与MAT1存在靶向结合位点;采用双荧光素酶实验对靶向关系进行验证显示,lncRNA JPX可与miR-1265靶向结合并对miR-1265表达具有抑制作用,miR-1265可与MAT1靶向结合并对MAT1表达具有抑制作用。进一步将C666-1细胞随机分为对照组、JPX降表达组、JPX降表达+miR-1265降表达组、JPX降表达+MAT1降表达组,分别转染NC对照序列、sh-JPX序列、sh-JPX+miR-1265 inhibitor序列、sh-JPX+si-MAT1序列。采用Western blotting法检测各组细胞MAT1蛋白表达、MTT法观察细胞增殖能力,Transwell实验观察细胞侵袭能力。结果细胞活力、侵袭细胞数JPX高表达组>高表达对照组、降表达对照组>JPX降表达组(P均<0.05)。MAT1蛋白表达、细胞活力及侵袭细胞数对照组、JPX降表达+miR-1265降表达组>JPX降表达组>JPX降表达+MAT1降表达组(P均<0.05)。结论lncRNA JPX可促进鼻咽癌细胞的增殖、侵袭,其机制可能与靶向调控miR-1265/MAT1轴有关。

格上可撤销的基于身份的加密算法研究

格上可撤销的基于身份的加密算法(RIBE)不仅能有效地解决实际生活中用户密钥撤销或更新的问题,还能抵抗量子算法攻击,吸引了众多密码学研究者的兴趣。文章通过运用基于近似陷门的非球面高斯采样技术,对RIBE方案中的系统公钥、用户私钥和更新密钥等生成算法进行改进,以缩减密钥尺寸,从而提高方案的空间效率。文章通过对同一水平下的解密错误率与原方案进行比较,可以观察到本方案的主公钥、主私钥、用户私钥、更新密钥和解密密钥的存储空间相较于原方案得到了一定的缩减。特别地,对于不同的安全级别,在保持同一解密错误率前提下,该方案的MPK尺寸缩减了32.29%~41.93%,MSK尺寸缩减了31.25%~38.70%,用户私钥及解密密钥尺寸缩减了59.13%~69.95%,密文尺寸缩减了32.27%~41.91%。

双硫死亡相关LncRNA的胃癌预后模型构建与验证

目的 基于二硫化物应激导致的新型细胞死亡类型,探究与其相关的长链非编码RNA(LncRNA)在胃癌中的作用,建立双硫死亡相关的胃癌预后模型,为胃癌治疗的预后情况评估提供新的方式。方法 使用公开数据库TCGA获得胃癌与正常组织样本的转录组数据,并通过Pearson分析与LASSO-Cox回归分析挑选双硫死亡相关LncRNA。基于上述LncRNA构建出相关的胃癌预后模型,并通过功能富集分析、肿瘤微环境和免疫细胞浸润分析、药物敏感性分析、定量逆转录PCR(RT-qPCR)等进行验证。结果 本研究识别出400个双硫死亡相关的LncRNA,并筛选出其中5个构建预后模型,用于评估胃癌患者的预后情况。模型在验证中显示,高风险评分组的生存期明显短于低风险评分组(P<0.05)。此外,预后模型的预测能力(AUC=0.725)优于仅依据年龄和性别等基本特征进行预测。双硫死亡相关LncRNA在正常组织与胃癌组织中的表达水平存在显著差异(P<0.001)。结论 该研究构建的双硫死亡相关LncRNA预后模型可以用于评估胃癌患者的预后情况和肿瘤微环境,为胃癌新的免疫治疗策略提供潜在的靶点和理论基础。

LncRNAs-MEG3对鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的:研究长链非编码RNA母系表达基因3(LncRNAs-MEG3)对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并探讨其可能机制。方法:体外培养鼻咽癌细胞系TW03、CNE-2,转染MEG3后分为空白对照组(NC)、阴性转染组(阴性对照质粒转染)和实验组(MEG3 mimis质粒转染)。采用实时定量PCR检测鼻咽癌细胞中LncRNAs-MEG3含量,CCK-8检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移和侵袭能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:与正常鼻咽上皮细胞系NP69相比,鼻咽癌细胞中MEG3的表达明显降低(0.62±0.04)(P<0.05)。与空白对照组、阴性转染组相比,实验组中MEG3 mRNA的表达升高(5.31±0.12)(F=441.062,P<0.01),同时检测到鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭均减少(F=10.832,P<0.05;F=1 534.134,P<0.05;F=1 430.212,P<0.05),凋亡增多(F=798.066,P<0.05),差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论:MEG3在鼻咽癌中的表达降低,提高MEG3表达则能够抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力,并促进细胞的凋亡,机制可能与抑制上皮-间质转化有关。

阿托伐他汀钙对人脐静脉内皮细胞增殖迁移的影响观察、关键靶基因及其相关lncRNA筛选

目的观察阿托伐他汀钙对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞增殖及迁移的影响,筛选阿托伐他汀钙对HUVECs作用的关键基因和共相关长链非编码核糖核酸(lncRNA)。方法取对数生长期HUVECs细胞,分为一组、二组,一组、二组细胞分别加入5μmol/L的阿托伐他汀钙及等量PBS培养24 h。①阿托伐他汀钙对HUVECs细胞增殖及迁移的的影响观察。取两组细胞,使用流式细胞仪测算两组细胞周期、采用CCK-8法观察两组细胞增殖情况、采用划痕愈合实验观察两组细胞迁移情况。②阿托伐他汀钙对HUVECs作用的关键基因和共相关lncRNA筛选。取两组细胞,运用illumina平台检测两组细胞mRNA、lncRNA,使用R Studio软件中的limma包筛选|log2 Fold change|>1.5、校正P<0.05的差异表达mRNA和lncRNA,运用基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析法分析差异表达mRNA的生物学功能。通过STRING数据库分析差异表达mRNA的蛋白互作用,使用CytoNCA插件筛选介数中心性最高的前10位关键基因,筛选与关键基因Pearson相关性系数>0.99的共表达lncRNA。采用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测两组关键基因及其共表达lncRNA。结果与二组相比,一组细胞周期GO/G1期比例高、细胞增殖抑制,培养24 h细胞迁移面积小(P均<0.05)。与二组相比,一组细胞有1510个差异表达mRNA、744个差异表达lncRNA;差异表达mRNA的生物学功能涉及294个GO集及27条KEGG通路;关键基因共10个,与其共表达的lncRNA有130个,包括AC017101.1、AC125257.1及AC004846.1等。与二组相比,一组细胞HSP90AA1、CDK4、CCND1、PLK1、PCNA相对表达量降低,AC017101.1、AC125257.1、AC004846.1、AL390719.1相对表达量升高(P均<0.05)。结论阿托伐他汀钙能阻滞HUVECs的细胞周期于GO/G1期、抑制细胞的增殖和迁移。阿托伐他汀钙对HUVECs作用的关键基因有HSP90AA1、CDK4及CCND1等10个,共相关lncRNA有AC017101.1、AC125257.1及AC004846.1等130个。阿托伐他汀钙可能通过促进AC017101.1、AC125257.1及AC004846.1等共相关lncRNA表达,下调HUVECs细胞中HSP90AA1、CDK4及CCND1等关键基因表达,阻滞HUVECs的细胞周期、抑制细胞增殖及迁移。

长链非编码RNA-P21在过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞损伤中的表达

目的检测过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞HLE-B3生物活性及长链非编码RNA-p21(lncRNA-p21)的表达变化。方法将HLE-B3细胞分为正常对照组和过氧化氢组,分别用正常培养液和含200μmol/L过氧化氢的培养液培养24 h。采用MTS比色法检测细胞活力;采用活性氧试剂盒检测细胞活性氧簇(ROS)的水平;采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;采用Caspase-3活性试剂盒法检测细胞Caspase-3活性;采用Western Blot方法检测细胞凋亡相关Bax,Bcl-2蛋白表达;采用流式细胞术检测细胞周期分布;采用EDU增殖试剂盒检测细胞增殖能力;采用实时荧光定量PCR法检测细胞中lncRNA-p21的表达;采用荧光原位杂交实验法检测细胞中lncRNA-p21的定位。结果过氧化氢组细胞ROS水平为4.65±0.38,明显高于正常对照组的1.00±0.01,差异具有统计学意义(t=16.66,P<0.05)。与正常对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率显著上升,Caspase-3活性增强,凋亡蛋白Bax相对表达量明显升高,差异均有统计学意义(t=20.69、39.80、12.73,均P<0.05)。与正常对照组相比,过氧化氢组G2期细胞比例明显增多,差异有统计学意义(t=23.10,P<0.05)。过氧化氢组EDU阳性细胞比例为(25.41±6.99)%,明显低于正常对照组的(50.58±9.15)%,差异具有统计学意义(t=6.559,P<0.05)。过氧化氢组lncRNA-p21相对表达量为2.36±0.29,明显高于正常对照组的1.02±0.02,差异具有统计学意义(t=7.893,P<0.05)。荧光原位杂交实验结果显示,lncRNA-p21定位于细胞质中。结论过氧化氢诱导的氧化应激模型中晶状体上皮细胞增殖能力显著降低、凋亡水平显著上升,ROS和lncRNA-p21表达水平升高。lncRNA-p21可能参与晶状体上皮细胞的氧化应激损伤过程。

非编码RNA对牛前体脂肪细胞分化的研究进展

肌内脂肪含量是评价牛肉等级和价值的重要指标,其取决于肌内前体脂肪细胞的增殖与分化。前体脂肪细胞分化是一个高度协调的过程,受到激素、转录因子、细胞因子及表观调控等多种因素调控。非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)是一类不编码蛋白质的表观遗传学调节因子,在前体脂肪细胞分化过程中发挥重要作用,其鉴定、功能和调节机制研究已成为牛脂肪沉积的研究热点。该文在简单介绍ncRNA分类、作用机制的基础上,详细阐述了miRNA、lncRNA和circRNA等3种类型的ncRNAs在不同品种、不同性别牛脂肪组织中的表达规律及在前体脂肪细胞分化中的研究进展,以期为解析ncRNA调控牛脂肪细胞分化机制奠定理论基础,并为今后ncRNA在肉牛分子育种提高肌内脂肪含量方面的应用提供理论参考。

基于多特征融合的细胞特异性lncRNA的亚细胞定位预测

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在细胞生物学过程和疾病发展中扮演着关键性角色。由于lncRNA的亚细胞定位和其生物学功能密切相关,因此确定lncRNA的亚细胞定位具有重要意义。目前已有一些基于机器学习的方法来识别lncRNA的亚细胞位置,但在识别人类lncRNA的细胞特异性定位方面的相关工作仍然有限。该模型对人类细胞系lncRNA亚细胞定位问题进行了研究,提取了k-mer、CKSNAP、SRS和TSS特征信息,并对各类特征信息进行了融合,基于XGBoost和LightGBM结合的算法来预测人类细胞系lncRNA的亚细胞位置,并通过10倍交叉检验对模型进行了评估。结果表明,该模型预测人类细胞系lncRNA亚细胞定位的方法与现有的预测方法相比,预测成功率均有一定改进,其基准数据集的AUROC值最高达到92.26%。

NKILA-miR-889-3p轴在调控口腔鳞状细胞癌细胞增殖迁移与侵袭中的作用

目的:通过分析长非编码RNA NKILA在口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的表达及其临床意义,探讨NKILA与其潜在靶向miRNA之间的交互调控机制,以阐明其在OSCC发展中的作用。方法:收集了80例经病理学证实的OSCC患者及相应邻近正常口腔黏膜组织样本,使用qRT-PCR检测NKILA的表达水平及其与预后。利用克隆形成实验和Transwell迁移侵袭实验评估NKILA对OSCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。通过亚细胞分离实验确定NKILA的亚细胞定位,并使用LncBase预测NKILA的潜在靶miRNA。AGO_(2)免疫沉淀实验用于验证miR-889-3p与NKILA的交互作用。结果:与相应的正常组织相比,NKILA在OSCC组织中的表达显著降低(P<0.0001),且其低表达与OSCC患者的晚期TNM分期、淋巴结转移和远处转移显著相关(P=0.001,P=0.046,P=0.011)。细胞实验结果表明,NKILA的敲低显著促进了OSCC细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05),而NKILA的过表达则显著抑制了这些细胞功能(P<0.05)。亚细胞定位实验显示NKILA主要位于细胞质。miR-889-3p被识别为NKILA的潜在靶点,过表达NKILA可显著上调miR-889-3p的表达(P<0.05),反之亦然。AGO_(2)免疫沉淀实验进一步证实了miR-889-3p能特异性结合并调节NKILA(P<0.05)。结论:本研究明确了NKILA在OSCC发展中的下调现象及其潜在的功能机制,揭示了NKILA与miR-889-3p之间的重要交互调控关系,为OSCC的研究和治疗提供了新的见解。

miR-144/451的体外红系发生示踪揭示LINC01569的潜在红系发生调控影响

目的用已构建的miR-144-GFP-H1人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)示踪细胞株,以GFP荧光信号报告miR-144表达描述红系发生的进展程度,探究在红系发生过程中lncRNA的潜在功能并初步验证其功能影响。方法利用已构建的miR-144/451-GFP-H1细胞株(下文简称144-H1)进行体外红细胞诱导培养。以CD71,GPA表面分子描述进入红系发生阶段的细胞亚群。以miR-144的GFP报告基因为关键区分,对GFP阳性(高红系发生倾向)和阴性细胞群(低红系发生倾向)分别进行转录组测序,获取差异性表达的lncRNA。选取具备验证价值的lncRNA条目进行初步功能验证。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术设计对应lncRNA的功能干扰方案并获取对应lncRNA功能敲除的144-H1细胞株。使用该敲除细胞株与非敲除的144-H1细胞株进行红细胞的平行诱导培养,寻找差异节点,初步验证其对在体外发育模型下对红系发生的影响效应。结果1)构建的144-H1细胞株能够在进入体外红细胞诱导阶段后表达GFP荧光蛋白,提示miR-144的启动。2)在CD71,GPA双阳群中,GFP阳性亚群和GFP阴性亚群存在显著的lncRNA表达差异。3)对多个lncRNA条目设计了能够有效干扰其功能的序列区段删除基因编辑方案。验证编辑成功。在敲除细胞株中,lncRNA的一部分序列被直接删除。4)在红细胞诱导培养的平行验证试验中,LINC01569的功能敲除株对比非敲除株表现出明显的流式亚群差异和细胞增殖能力差异:①敲除株的GFP荧光持续高表达;②敲除株CD71-GPA双阳群在红细胞成熟过中比例持续降低;③敲除株未观察到显著的血红蛋白表达,无明显红色;④敲除株细胞增殖能力远低于非敲除株(P<0.05)。结论成功利用144-H1细胞株对lncRNA在红系发育中的潜在功能进行了探究,可设计更精密的体外发育实验来提高lncRNA功能的抓取精度。在差异性表达的lncRNA条目中,LINC01569经初步验证,对红系发生过程存在调控作用。LINC01569的功能缺失严重影响红细胞的正常分化与增殖。LINC01569在红系发生过程中的具体调控机制有待进一步探索与研究。

长链非编码RNA(lncRNA)-MSTRG.22610.1对BHV-1体外复制影响的研究

本研究室前期将牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)感染牛肾细胞(MDBK),通过转录组测序筛选到了转录显著差异的长链非编码RNA-MSTRG.22610.1(lncRNA-MSTRG.22610.1),为了探究其在MDBK中对BHV-1复制的影响,本研究采用CCK-8法筛选对细胞无毒性的聚凝胺、嘌呤霉素的最佳浓度;将重组慢病毒r ZHLV-U6-Zs Green1-puro-MSTRG.22610.1和r ZHLV-U6-Zs Green1-puro(对照慢病毒)按照不同的MOI分别感染MDBK细胞,48 h后观察荧光,采用Image J软件检测并计算各慢病毒感染细胞后出现绿色荧光细胞的比率,出现绿色荧光细胞的比率达80%的细胞对应的MOI即为最佳MOI。筛选结果显示聚凝胺与嘌呤霉素的最佳工作浓度分别为5μg/mL及3μg/m L,慢病毒感染的最适MOI为80。将r ZHLV-U6-Zs Green1-puro-MSTRG.22610.1和对照慢病毒分别以最佳条件感染MDBK细胞并培养及传代,传至8~10代,每代均观察细胞形态及细胞中的绿色荧光,并通过RT-q PCR检测第6、8、10代细胞中lncRNA-MSTRG.22610.1的转录水平,以构建并鉴定稳定表达lncRNA-MSTRG.22610.1的MDBK细胞系1T及对照细胞系1NC。结果显示,每代1T细胞、1NC细胞的状态均良好并均与阴性对照MDBK细胞的形态无差别,且每代1T及1NC细胞均出现绿色荧光。RT-q PCR结果显示,与1NC及阴性对照细胞相比,1T细胞系中lncRNA-MSTRG.22610.1的转录水平极显著升高(P<0.0001)。表明获得了高水平表达lncRNA-MSTRG.22610.1却不影响细胞增殖的细胞系,且该细胞系的遗传稳定性较强。将BHV-110倍倍比稀释后分别感染传至10代的1T与1NC细胞,24 h后采用Reed-Muench法计算各组细胞中的病毒滴度。结果显示,1T、1NC及MB细胞(感染BHV-1的MDBK细胞)的病毒滴度分别为105.15 TCID50/0.1 m L、104.41TCID50/0.1 m L及104.58 TCID50/0.1 m L。与MB和1NC细胞相比,1T细胞中的病毒滴度显著升高(P<0.05),表明lnc RNA-MSTRG.22610.1表达后促进BHV-1在MDBK细胞中的复制。本研究为进一步探究lncRNA-MSTRG.22610.1促进病毒复制的分子机制及深入了解BHV-1感染的分子机制提供参考依据。

动脉粥样硬化机制研究的新认识

动脉粥样硬化是一种主要累及大、中等动脉的慢性血管性病变,涉及多种复杂的因素。近年来,动脉粥样硬化领域涌现了诸如炎症、肠道菌群、细胞焦亡、铁死亡、自噬、铜死亡、外泌体和非编码RNA等多个研究热点,该文旨在综述这些方向的研究进展,以期为动脉粥样硬化的发生机制和相关疾病的诊疗提供新的思路。