脂多糖诱导年轻小鼠骨髓及脾脏造血干细胞衰老表型的作用研究

目的:探究脂多糖诱导的炎症反应对年轻小鼠骨髓及脾脏中造血干/祖细胞衰老表型的影响。方法:(1)构建细菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的急性炎症小鼠模型,流式细胞术检测LPS刺激后年轻小鼠骨髓和脾脏中造血干/祖细胞的百分率,以及外周血和脾脏中各类成熟细胞百分率;通过增殖标记物Ki67检测小鼠骨髓和脾脏中造血干/祖细胞增殖的变化;检测炎症刺激后脾脏中造血干/祖细胞CD45蛋白的表达变化;(2)分析野生型年轻小鼠(2月龄)和年老小鼠(24月龄)骨髓和脾脏中造血干/祖细胞,外周血和脾脏中各类成熟细胞的百分率;(3)生物信息分析LPS刺激诱导造血干细胞转录组的变化。结果:(1)与对照组小鼠相比,体内LPS刺激导致小鼠骨髓中造血干/祖细胞百分率显著升高(P<0.05),外周血和脾脏中髓系细胞百分率显著升高(P<0.05);(2)与对照组小鼠相比,体内LPS刺激导致小鼠脾脏重量和细胞数目增多(P<0.05),脾脏中造血干/祖细胞百分率增多(P<0.05);(3)LPS刺激促进小鼠骨髓和脾脏中的造血干/祖细胞增殖(P<0.05);(4)LPS刺激导致小鼠脾脏中造血干/祖细胞CD45蛋白的表达降低(P<0.01);(5)与年轻小鼠相比,年老小鼠脾脏重量增加(P<0.05),脾脏中的造血干/祖细胞百分率增多(P<0.01);(6)与年轻小鼠相比,年老小鼠骨髓中的造血干细胞百分率显著升高(P<0.01),外周血和脾脏出现髓系分化偏向(P<0.01);(7)LPS刺激促进造血干细胞氧化应激和凋亡信号通路激活。结论:LPS刺激诱导造血干/祖细胞出现增殖,偏向髓系分化,髓外造血以及氧化应激、凋亡信号通路激活等造血干/祖细胞衰老表型。

C⁃erbB⁃2和C⁃MYC基因在非小细胞肺癌中的表达及其与预后的关系

目的探讨C⁃erbB⁃2和C⁃MYC基因在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其与预后的关系。方法选取2016年1月至2018年3月河西学院附属张掖人民医院89例NSCLC患者,所有患者均行肺癌根治术,术中切除癌组织以及距病灶3 cm的癌旁组织制作石蜡切片。采用免疫组化技术检测NSCLC癌组织以及癌旁组织C⁃erbB⁃2及C⁃MYC表达情况。对所有患者进行5年随访,分析生存情况。结果NSCLC癌组织的C⁃erbB⁃2阳性表达率为43.82%,高于癌旁组织的7.87%(χ^(2)=30.018,P<0.001)。NSCLC癌组织的C⁃MYC阳性表达率为61.80%,高于癌旁组织的17.98%(χ^(2)=35.637,P<0.001)。C⁃erbB⁃2阳性患者的总生存期为10.6~60.0个月,5年生存率为38.46%;C⁃erbB⁃2阴性患者的总生存期为13.4~60.0个月,5年生存率为58.00%;两组总生存期比较差异有统计学意义(Log rank=4.086,P=0.043)。C⁃MYC阳性患者的总生存期为10.6~60.0个月,5年生存率为38.18%;C⁃MYC阴性患者的总生存期为15.5~60.0个月,5年生存率为67.65%;两组总生存期比较差异有统计学意义(Log rank=8.141,P=0.004)。结论C⁃erbB⁃2和C⁃MYC表达情况与NSCLC患者预后密切相关,可作为分子标志物评估NSCLC患者预后。

癌化学预防药维胺酸的药理学研究

维胺酸(N-4-(hydroxycarbophenyl)-retinamide;RⅡ)在30～50mg/kg的剂量下对大鼠移植性软骨肉瘤有明显治疗作用。 低浓度的RⅡ对HL-60细胞有较弱的分化诱导活性,同时加入S86019可使其活性增强。流式细胞光度术分析表明,RⅡ可使HL-60细胞产生G_1期阻断,与S86019联合应用有良好协同阻断效应,使90％细胞积聚在G_1期,Northern blot分析表明,用RⅡ和S86019联合处理HL-60细胞12h后,c-myc表达明显受到抑制,与DNA合成密切相关的胸腺嘧啶核苷酸合成酶mRNA表达也受到抑制。

源于成人骨髓神经干细胞诱导分化的实验研究(英文)

目的研究成人骨髓分离培养神经干细胞的可行性,为进一步自体移植治疗脑退行病变的临床应用奠定基础。方法以20例成年男/女性(28～48岁)骨髓自愿捐献者为取材对象,骨穿术后经梯度密度离心分离获取的成人骨髓基质细胞用“Cytokine·神经干细胞培养液”培养,确定神经干细胞的最佳体外生存环境。以细胞克隆方法判断神经干细胞增殖;以巢蛋白(Nestin),神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质原性纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学方法分别鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。所涉及的细胞因子主要有脑源性神经营养因子(BDNF)、白血病抑止因子(LIF)(10μg/L)和维A酸(RA)(0.5mg/L)等。结果成人骨髓基质细胞在相应培养条件下快速分裂增殖为神经干细胞,并由含粗大胞质颗粒的多个神经干细胞组成岛屿状细胞球(神经球),该细胞球表达特殊的神经干细胞Nestin抗原;进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养,单个的细胞又很快变成岛屿状神经球。神经干细胞球进一步分化,则可见到有的细胞胞体增大并出芽、逐渐发育成为较成熟的长突起细胞,长突起相互连接、交织成网,分化的长突起细胞表达NSE或GFAP。结论成年人骨髓在一定条件诱导下可以生成神经干细胞;用人骨髓组织诱导神经干细胞作为种子细胞具有可行性。

EGb761对血管性痴呆大鼠海马齿状回神经干细胞增殖分化的影响

目的:探讨中药银杏叶提取物(EGb761)对血管性痴呆(vascular dementia,VD)模型大鼠海马齿状回(DG)NSCs增殖分化的影响及机制。方法:采用双侧颈总动脉夹闭再灌注同时腹腔注射硝普纳建立VD模型,在15 d,1,2,4个月等时间点,采用Morris水迷宫检测和BrdU和/或神经颗粒素(Ng)标记的免疫荧光单标和双标技术分别观察大鼠的学习记忆能力变化和NSCs的增殖与功能分化情况。结果:(1)模型组大鼠的逃逸潜伏期(EL)均明显长于假手术组(P<0.01),药物组大鼠的EL较模型组明显缩短(P<0.05),但仍长于假手术组(P<0.01)。(2)免疫荧光标记显示,各个时间点,药物组DG区NSCs在增殖分化的数量、强度和持续时间上,都明显优于假手术组和模型组。结论:EGb761能促进VD模型大鼠神经干细胞的增殖分化,显著改善VD大鼠的学习记忆能力。

丙戊酸钠联合粒细胞集落刺激因子诱导髓系白血病细胞分化作用机制的探讨

目的探讨丙戊酸钠(VPA)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)联合用药对急性髓细胞白血病细胞株U937的诱导分化的作用机制。方法选取对数生长期U937细胞,分别经0.5 mmol/L VPA、50 ng/ml G-CSF单药或两者联合处理后,采用瑞氏染色观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面抗原及G-CSF受体(G-CSFR)的变化,免疫印迹法检测髓系分化相关转录因子增强子结合蛋白(C/EBPα)及G-CSFR在处理前后的表达。结果 VPA可以诱导U937细胞髓系分化,其表面抗原CD11b表达从(11.49±3.48)%升至(62.48±9.96)%(P<0.05),联合G-CSF后CD11b表达升至(97.65±0.49)%(P<0.05)。流式细胞检测VPA能够使U937细胞表面的G-CSFR表达率从(29.50±6.80)%增至(59.88±9.99)%。VPA能够上调U937细胞C/EBPα的蛋白表达,使细胞G-CSFR蛋白水平明显升高。结论 G-CSF可以加强VPA诱导髓系白血病细胞分化。VPA可能是通过抑制组蛋白去乙酰化酶活性,促进分化转录因子C/EBPα的表达恢复及上调G-CSFR,从而发挥联合诱导分化作用。

烟草花柄离体培养中花芽分化的细胞起源观察

烟草(Nicotiana tabacum L.cv.GeXing 1)花柄薄层细胞块或花柄切段在培养基(MS+IBA 2mg/L+6-BA 0.2mg/L)中培养12天后可观察到直接再生的花牙。石蜡切片观察表明:花芽原基起源于花柄薄层细胞块和花柄切段的表皮下细胞。此外,在花柄薄层细胞块和花柄切段的皮层薄壁细胞部位以及花柄切段的维管组织形成层区域,也观察到细胞分生中心。因此,皮层薄壁细胞、形成层细胞也可能是花芽分化的起源。

大鼠脂肪源干细胞中骨形态发生蛋白信号通路相关分子的表达

目的：探讨大鼠脂肪源干细胞（ADSCs）成骨和成脂肪分化能力及骨形态发生蛋白（BMP）信号通路相关分子的表达.方法：切取Wistar雌性大鼠腹股沟脂肪垫,用酶消化法培养ADSCs.将第4代ADSCs经成骨和成脂肪诱导分化培养后,进行相应的茜素红和油红O染色,以鉴定ADSCs的分化潜能.同时取培养的第4代ADSCs进行流式细胞术检测部分表面抗原.提取ADSCs的总RNA进行RT-PCR,检测BMP信号通路相关分子mRNA的表达.结果：光学显微镜下观察贴壁ADSCs形态多呈梭形、多边形,细胞大小均匀;流式细胞术鉴定ADSCs的表面抗原显示CD90、CD106呈阳性,CD45、CD49d呈阴性;成脂诱导培养14d后,油红O染色显示特异性脂滴,而阴性对照孔中未观察到红染的脂滴.成骨诱导培养21d后,茜素红染色显示矿化结节呈特异性的粉红色,阴性对照孔中未见被染成粉红色的钙结节;RT-PCR检测结果显示BMP信号通路相关分子Bmpr1a、Bmpr1b、Bmpr2; Smad1、Smad5、Smad8的mRNA均阳性表达.结论：ADSCs具有多向分化潜能,可向成骨和成脂肪分化;ADSCs可能存在BMP信号通路.

Nurr1对小胶质细胞联合神经干细胞共培养促进神经干细胞向多巴胺神经元分化作用研究

目的探讨联合过表达核受体相关因子1(Nurr1)基因的小胶质细胞(MG)和神经干细胞(NSC)共培养对神经干细胞向多巴胺神经元分化的影响。方法原代培养SD大鼠神经干细胞和小胶质细胞,并过表达Nurr1基因。CCK-8法检测Nurr1过表达对神经干细胞以及小胶质细胞活率的影响。Transwell系统共培养神经干细胞和小胶质细胞,实验分为NSC组、NSC+MG组和N(NSC+MG)组。ELISA检测共培养后第3天、第6天和第9天各组脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板源性神经营养因子(PDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达变化;RT-PCR和Western Blot检测各组第9天酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运蛋白(DAT)DAT和Nurr1的表达变化;细胞免疫荧光鉴定神经干细胞的分化,并对TH和DAT阳性细胞计数,计算各组神经干细胞向多巴胺神经元的分化效率。结果原代培养小胶质细胞以及神经干细胞并成功过表达Nurr1基因。CCK-8法检测结果表明,Nurr1过表达对神经干细胞以及小胶质细胞活率无明显影响。ELISA检测结果表明,N(NSC+MG)组在不同时间点神经营养因子(BDNF、PDNF和GDNF)表达量明显高于其他各组(P<0.05)。RT-PCR和Westen Blot检测结果表明,N(NSC+MG)组TH、DAT和Nurr1的表达水平明显高于其他各组(P<0.05)。细胞免疫荧光鉴定结果表明,N(NSC+MG)组TH阳性细胞率明显高于其他各组(P<0.05)。结论Nurr1基因可促进神经干细胞和小胶质细胞共培养系统神经营养因子的分泌。过表达Nurr1基因的神经干细胞和小胶质细胞共培养可促进神经干细胞向多巴胺神经元的分化。

TDG介导的去甲基化在细胞发育分化及肿瘤发生中的研究进展

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,可对生命发生发展阶段中的基因表达进行调控。近来研究发现,胸腺嘧啶DNA糖苷酶(thymine DNA glycosylase, TDG)是能特异修复G:T错配的酶,在DNA去甲基化过程中起到重要作用。TDG与TET、AID、Gadd45a等蛋白协同,通过碱基切除修复(base excision repair, BER)作用参与DNA去甲基化过程。此外,TDG介导的BER作用能去除甲基化中间产物的5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)及其衍生物的积累、消除5-甲基胞嘧啶(5-methylcyosine, 5mC)自发脱氨基导致的突变,保持基因组的遗传稳定性。TDG的表达下降或酶的失活会引起基因组稳定性降低,增加肿瘤发生的风险。TDG介导的DNA去甲基化修饰调节影响胚胎发育、细胞分化与衰老的过程,其对癌症的发生也有着不可忽视的作用。

微小RNA-218-5p靶向Jagged 1调控人牙周膜干细胞的活性和骨向分化

目的研究微小RNA-218-5p(miR-218-5p)对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)活性和骨向分化的影响并探讨其机制,为牙周炎的治疗提供研究基础。方法将anti-miR-218-5p组(转染anti-miR-218-5p)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-JAG1组(转染pcDNA-JAG1)、anti-miR-218-5p+si-NC组(共转染anti-miR-218-5p和si-NC)、anti-miR-218-5p+si-JAG1组(共转染anti-miR-218-5p和si-JAG1),用脂质体法转染至hPDLSCs细胞;运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测细胞中miR-218-5p、Ⅰ型胶原蛋白(Col-1)、骨钙素、Runt相关转录因子2(Runx2)的表达;蛋白质印迹法(Westrn blotting)检测细胞中Jagged 1(JAG1)的蛋白表达;MTT法检测细胞活性;茜素红染色实验检测细胞的矿化结节;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性。结果与anti-miR-NC组相比,anti-miR-218-5p组hPDLSCs细胞培养48、72 h时,细胞活性升高[48 h:(0.44±0.04)比(0.62±0.06);72 h:(0.53±0.05)比(0.83±0.08);P<0.001],细胞的矿化结节明显升高,Col-1[(0.26±0.03)比(0.74±0.07)]、骨钙素[(0.21±0.02)比(0.54±0.05)]、Runx-2[(0.29±0.03)比(0.61±0.06)]蛋白相对表达量均显著升高(均P<0.001)。与pcDNA组相比,pcDNA-JAG1组hPDLSCs细胞培养48、72 h时,细胞活性显著升高[48 h:(0.42±0.04)比(0.59±0.05);72 h:(0.55±0.05)比(0.81±0.08);P<0.001],Col-1[(0.34±0.03)比(0.71±0.07)]、骨钙素[(0.23±0.02)比(0.48±0.04)]、Runx-2[(0.25±0.03)比(0.56±0.05)]蛋白表达量均显著升高(均P<0.001)。miR-218-5p可靶向调控JAG1的表达。抑制JAG1可逆转抑制miR-218-5p对hPDLSCs的活性和骨向分化作用。结论抑制miR-218-5p可促进人牙周膜干细胞活性和骨向分化,其机制与靶向JAG1有关。

日本血吸虫可溶性成虫抗原及虫卵抗原对CD4^+T细胞分化的影响

目的观察并比较日本血吸虫可溶性成虫抗原(SWA)及虫卵抗原(SEA)在诱导CD4+T细胞分化中的不同作用。方法分别用SWA、SEA免疫C57BL/6小鼠后分离脾细胞,或用SWA、SEA体外刺激正常小鼠来源的脾细胞后,采用流式细胞术(FCM)检测脾细胞中产生IFNγ及IL 4的细胞比例,以及CD4+T细胞中Th1、Th2细胞亚群的比例。结果SWA比SEA更能优势诱导CD4+T细胞产生IFNγ(P<0.05),SEA比SWA更能优势诱导CD4+T淋巴细胞产生IL 4(P<0.05)。结论SWA较SEA更能优势诱导Th1细胞分化,SEA较SWA更能优势诱导Th2细胞分化。

人骨膜细胞体外成骨分化的基因表达和功能检测

目的探讨并鉴定骨膜细胞经骨形成蛋白7（BMP7）诱导分化为成骨细胞的基因表达和细胞功能。方法成人胫骨骨膜常规体外细胞培养法，分实验组和对照组，分别加入BMP7加成骨辅助剂和单纯成骨辅助剂进行体外培养。CCK-8法检测细胞增殖活性，第5、10、15和20天分别采用Real陆ne-PCR检测骨钙素基因表达，ELISA法检测上清液碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（osteoealein，OCN）及骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的水平，甲苯胺蓝染色检测糖胺聚糖（GAG），RealTime-PCR检测Ⅱ型胶原基因，比色法检测细胞ALP活性，ALP染色法检测ALP，VonKossa染色法检测钙结节。结果两组骨钙素基因表达及上清液ALP、骨钙素、骨桥蛋白的含量均增高，实验组与对照组差异有统计学意义（P〈0．05）。两组细胞的ALP和钙结节染色阳性率增高，实验组与对照组差异有统计学意义（P〈0．05）。甲苯胺蓝染色阳性率及Ⅱ型胶原基因表达表现为先高后低，实验组与对照组差异有统计学意义（P〈0．05）。结论骨膜细胞在BMP7诱导下体外大量增殖和分化成骨，表达出明显的成骨特异基因，并具有合成分泌成骨特异蛋白的功能；成骨化过程中，除直接分化成骨外，还存在部分细胞先经软骨形成再钙化成骨的现象；经骨膜细胞．BMP7途径在体外获取大量成骨细胞可用于组织工程的体外构骨及临床应用。

丹参联合骨髓间充质干细胞移植治疗新生鼠缺氧缺血性脑损伤的实验研究

目的研究骨髓间充质干细胞(MSCs)植入缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠脑后,植入MSCs在脑组织中的迁移、神经细胞抗原分化率的变化,探讨丹参联合MSCs移植治疗新生儿HIE的可行性。方法将36只7日龄新生SD大鼠随机分为正常对照组(8只)、HIE组(8只)、MSCs移植组(10只)、MSCs移植+丹参组(10只)。在MSCs移植后18d取脑组织后做石蜡切片,免疫组织化学法检测并计数进入脑组织的MSCs,观察植入细胞在脑组织中的分布、迁移;免疫荧光双标记法检测植入细胞神经元巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,观察其向神经细胞的分化,并进行组间比较。结果植入MSCs主要分布于HIBD组左侧大脑皮质区,MSCs移植+丹参组标本中MSCs更多向右侧大脑半球迁移,且分布范围更广,与MSCs移植组比较,不同脑组织层面、两侧大脑半球MSCs计数均有统计学差异(Pa<0.05);免疫荧光双标记法观察MSCs主要在左侧大脑皮质、海马等部位分化为神经细胞,Nestin、NSE、GFAP均可表达。MSCs移植+丹参组植入MSCs的Nestin、NSE分化率更高,且有统计学意义;MSCs移植组和MSCs移植+丹参组GFAP分化率比较差异无统计学意义。结论 MSCs植入HIBD新生大鼠脑组织后能存活,并在脑组织中移行,植入MSCs主要在HIBD新生鼠左侧脑皮质、海马等部位分化为神经细胞,表达Nestin、NSE及GFAP,加用丹参后可促进植入MSCs表达Nestin及NSE,对GFAP表达无影响。

BDNF基因重组慢病毒转染MSCs诱导分化神经样细胞的实验研究

目的将BNDF基因重组慢病毒转染MSCs,观察其体外诱导及脑内移植后分化神经样细胞的情况。方法分离培养大鼠MSCs;将携带有BDNF的慢病毒转染MSCs;镜下观察诱导后MSCs的形态变化;制备大鼠脑出血模型,并随机分为PBS组、MSCs组、MSCs-EGFP组、MSCs-EGFP-BDNF组,记录各组细胞移植7、14、21 d神经功能缺损评分、脑组织切片免疫荧光单标检测MSCs的脑内迁移、免疫荧光双标检测MSCs脑内分化神经样细胞的情况。结果镜下观察经BDNF基因重组慢病毒诱导的MSCs由均匀一致的长梭形逐渐呈现出有单极、双极甚至多极的类神经样细胞,而空病毒组及未转染组MSCs细胞形态无明显变化;移植入脑出血模型脑内后MSCs组、MSCs-EGFP组及MSCs-EGFP-BDNF组大鼠的神经功能评分与PBS组比较均有不同程度改善,其中MSCs-EGFP-BDNF组改善最为显著(P<0.05);MSCs-EGFP-BDNF组迁移至脑出血灶周围组织的MSCs明显多于MSCs组及MSCs-EGFP组(P<0.05),MSCs组与MSCs-EGFP组除7 d外其余比较无明显差异(P>0.05);MSCs-EGFP-BDNF组胶原纤维酸性蛋白阳性率明显高于MSCs组及MSCs-EGFP组(P<0.01),而MSCs组与MSCs-EGFP组比较无明显差异(P>0.05)。结论 BDNF基因重组慢病毒修饰的MSCs体外可诱导其向神经样细胞分化;移植后迁移至脑出血灶周围组织的细胞数较其它组明显增多;可促进脑出血大鼠的神经功能修复并检测到其分化为神经细胞标志物的表达。

大鼠注射型富血小板纤维蛋白诱导干细胞成神经分化

[目的]探讨注射型富血小板纤维蛋白(i-PRF)体外诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)成神经细胞分化的能力。[方法]自10~15 d龄SD乳鼠胫骨骨髓分离培养BMSCs至第4代。自SD乳鼠静脉血采用改良低速离心法备制i-PRF。将第4代BMSCs随机分为空白组、150μl组和300μl组,分别加入i-PRF 0、150、300μl,并加入12%FBS进行培养。于第7、14、21 d观察各组细胞形态改变并以免疫组化法及Western blot检测其神经分化情况。[结果]BMSCs经i-PRF诱导7 d后细胞形态开始改变,21 d后突触生长,出现类神经元细胞形态;而空白组细胞形态无改变。细胞免疫组化显示150、300μl组Nestin蛋白表达阳性,而空白组为阴性。免疫荧光染色结果显示150、300μl组S-100β蛋白表达阳性率显著高于空白组。Western blot检测结果表明Nestin、N-cadherin蛋白相对表达量依次为150μl组>300μl组>空白组,差异具有统计学意义(P<0.05)。[结论]i-PRF能有效诱导BMSc成神经细胞分化且受i-PRF剂量的影响。