为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该...为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该质粒连同辅助质粒共同转染至HEK293T细胞获得重组慢病毒;之后将重组慢病毒感染MARC-145细胞,利用嘌呤霉素结合有限稀释法进行筛选,连续筛选3轮后建立了稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系;并使用CCK-8试验评估过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞生长的影响。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光(IFA)评估MARC-145ORF6细胞系的传代稳定性并鉴定M蛋白的亚细胞定位,进一步利用RT-qPCR评估过表达M蛋白对MARC-145细胞的干扰素及相关调节基因的影响;此外,还测定了PRRSV在MARC-145ORF6细胞系、MARC-145Flag细胞系和MARC-145细胞中的病毒滴度并绘制多步生长曲线以比较其差异。CCK-8试验结果表明,过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞活力无显著影响;RT-qPCR、Westernblot和IFA等试验结果表明,MARC-145ORF6细胞系能够表达PRRSV的M蛋白且在传代过程中稳定。此外,稳定表达PRRSVM蛋白显著下调了细胞系的Ⅰ型干扰素及其相关调节基因;多步生长曲线表明,MARC-145ORF6细胞系促进PRRSV增殖,提高其病毒滴度。综上,本研究构建了可以稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系,发现其Ⅰ型干扰素水平显著下调且促进PRRSV复制。本研究构建的MARC-145ORF6细胞系将为M蛋白功能的深入研究提供重要生物材料。展开更多
Objective To establish stable prostate cancer bone metastasis cell line overexpressing microRAN-145 (miR-145)for the study of the mechanism of miR-145 in bone metastasis.Methods pMSCV-miR-145 plasmids and retroviruses...Objective To establish stable prostate cancer bone metastasis cell line overexpressing microRAN-145 (miR-145)for the study of the mechanism of miR-145 in bone metastasis.Methods pMSCV-miR-145 plasmids and retroviruses of pMSCV-vector展开更多
为了建立稳定表达猪FcγRⅢ(Porcine Fc gamma receptorⅢ,poFcγRⅢ)的Marc-145细胞系,从PAM细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术获得猪FcγRⅢ和γ链的cDNA,并构建PIREShyg3-γ和pcDNA3.1-FcγRⅢ真核表达质粒;用脂质体共转染Marc-145细胞...为了建立稳定表达猪FcγRⅢ(Porcine Fc gamma receptorⅢ,poFcγRⅢ)的Marc-145细胞系,从PAM细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术获得猪FcγRⅢ和γ链的cDNA,并构建PIREShyg3-γ和pcDNA3.1-FcγRⅢ真核表达质粒;用脂质体共转染Marc-145细胞,经潮霉素B(300 mg/L)和G418(400 mg/L)共筛选获得稳定表达猪FcγRⅢ的细胞系;运用RT-PCR、玫瑰花环试验和流式细胞术对细胞系进行了鉴定。结果表明,成功构建了猪FcγRⅢ和γ链真核表达载体,建立了稳定表达猪FcγRⅢ的细胞系,表达于转染细胞表面的猪FcγRⅢ受体分子能与猪IgG特异结合。展开更多
目的探讨雷公藤内酯醇(TP)对DU145/ADM细胞阿霉素敏感性及逆转耐药的影响。方法采用MTT法检测TP预处理DU145/ADM细胞对阿霉素敏感性的影响,采用RT-PCR和Western blot分别检测相关基因转录水平与蛋白水平的变化。结果不同浓度TP(20、40、...目的探讨雷公藤内酯醇(TP)对DU145/ADM细胞阿霉素敏感性及逆转耐药的影响。方法采用MTT法检测TP预处理DU145/ADM细胞对阿霉素敏感性的影响,采用RT-PCR和Western blot分别检测相关基因转录水平与蛋白水平的变化。结果不同浓度TP(20、40、80 ng mL-1)预处理DU145/ADM细胞72 h后,均可使细胞对不同浓度阿霉素(10、20、30、40、50 ng mL-1)敏感性较TP预处理前明显增加,mdr1表达较TP预处理前明显下降,并呈剂量相关性。结论 TP通过下调mdr1表达增强DU145/ADM细胞对阿霉素的敏感性,其有可能成为一种耐药逆转剂。展开更多
文摘为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该质粒连同辅助质粒共同转染至HEK293T细胞获得重组慢病毒;之后将重组慢病毒感染MARC-145细胞,利用嘌呤霉素结合有限稀释法进行筛选,连续筛选3轮后建立了稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系;并使用CCK-8试验评估过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞生长的影响。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光(IFA)评估MARC-145ORF6细胞系的传代稳定性并鉴定M蛋白的亚细胞定位,进一步利用RT-qPCR评估过表达M蛋白对MARC-145细胞的干扰素及相关调节基因的影响;此外,还测定了PRRSV在MARC-145ORF6细胞系、MARC-145Flag细胞系和MARC-145细胞中的病毒滴度并绘制多步生长曲线以比较其差异。CCK-8试验结果表明,过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞活力无显著影响;RT-qPCR、Westernblot和IFA等试验结果表明,MARC-145ORF6细胞系能够表达PRRSV的M蛋白且在传代过程中稳定。此外,稳定表达PRRSVM蛋白显著下调了细胞系的Ⅰ型干扰素及其相关调节基因;多步生长曲线表明,MARC-145ORF6细胞系促进PRRSV增殖,提高其病毒滴度。综上,本研究构建了可以稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系,发现其Ⅰ型干扰素水平显著下调且促进PRRSV复制。本研究构建的MARC-145ORF6细胞系将为M蛋白功能的深入研究提供重要生物材料。
文摘Objective To establish stable prostate cancer bone metastasis cell line overexpressing microRAN-145 (miR-145)for the study of the mechanism of miR-145 in bone metastasis.Methods pMSCV-miR-145 plasmids and retroviruses of pMSCV-vector
文摘目的探讨雷公藤内酯醇(TP)对DU145/ADM细胞阿霉素敏感性及逆转耐药的影响。方法采用MTT法检测TP预处理DU145/ADM细胞对阿霉素敏感性的影响,采用RT-PCR和Western blot分别检测相关基因转录水平与蛋白水平的变化。结果不同浓度TP(20、40、80 ng mL-1)预处理DU145/ADM细胞72 h后,均可使细胞对不同浓度阿霉素(10、20、30、40、50 ng mL-1)敏感性较TP预处理前明显增加,mdr1表达较TP预处理前明显下降,并呈剂量相关性。结论 TP通过下调mdr1表达增强DU145/ADM细胞对阿霉素的敏感性,其有可能成为一种耐药逆转剂。
