提高表达分选酶A的猪链球菌突变株的构建及初步评价

为了提高猪链球菌(Streptococcus suis,SS)05ZYH33菌株中分选酶A(SrtA)的表达量,本研究利用同源重组技术,将强启动子Peno、SrtA基因与红霉素抗性基因融合并转化05ZYH33野生菌株(05ZYH33-WT),构建SS SrtA提高表达的突变株05ZYH33-srtAe,并对05ZYH33-srtAe突变株和05ZYH33-WT进行生长特性分析和SrtA蛋白的western blot检测;进一步构建SS SrtA基因缺失株05ZYH33-srtA^(Δ)作为对照,通过检测05ZYH33-WT、05ZYH33-srtAe和05ZYH33-srtAΔ菌株表面蛋白SSU05_0630的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)的活性,初步评价SrtA的提高表达在SS表面蛋白锚定中的作用。Western blot结果显示,正确构建了SS SrtA提高表达的突变株05ZYH33-srtAe,且该菌株的生长速度和05ZYH33-WT基本相同,但SrtA的表达量却提高了2.4倍。菌株表面蛋白SSU05_0630的NAG活性检测结果显示,05ZYH33-srtA^(Δ)菌株的NAG活性和本实验室前期构建的SSU05_0630基因缺失株ssu05_0630^(Δ)相同,检测不到SSU05_0630蛋白的NAG活性,表明SSU05_0630蛋白是SrtA的底物,通过SrtA锚定到SS的表面。05ZYH33-srtAe和05ZYH33-WT菌株表面蛋白SSU05_0630的NAG活性无明显差异,即SrtA表达量的提高并没有提高SSU05_0630蛋白在SS表面的锚定量。本研究首次构建了提高SS SrtA表达量的突变株,并对SrtA表达量的提高是否对SS表面蛋白锚定产生影响进行了初步探究,为进一步研究SrtA表达量的提高对SS其他表面蛋白锚定量的影响,以及优化SS表面蛋白展示系统奠定了基础。

TGEV和PEDV融合S蛋白在乳酸乳球菌食品级细胞壁锚定高效诱导表达与免疫原性分析

近年来猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻在我国广泛流行,给养殖业带来了巨大的经济损失。目前对此两种疾病的防治手段还停留在使用常规疫苗。现有的疫苗免疫效果不够理想,急需寻求一种安全高效的防治手段。本文首先构建了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)融合S基因,以乳酸乳球菌食品级细胞壁锚定高效诱导表达载体p RNV48为基础,构建了TGEV和PEDV融合S基因的表达质粒p RNV48-TPs。将得到的重组质粒用电穿孔方法转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,获得了重组菌乳酸乳球菌Z9000/p RNV48-TPs。再利用nisin对重组菌进行诱导,提取细胞壁蛋白后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析目的蛋白的表达情况,然后分别对兔子进行注射免疫和口服免疫,并用Western Blot分析。通过乳酸乳球菌食品级细胞壁锚定高效诱导表达载体,诱导表达TGEV与PEDV融合S蛋白产生中和抗体,以期探讨口服疫苗的免疫反应机理,为由TGEV与PEDV研发的安全、高效的疫苗奠定良好的基础。