人载脂蛋白A-I的原核表达及二级结构和功能鉴定

目的为获得高产量并具有正常结构和生物学活性的原核表达人载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)。方法利用DNA重组技术对人apoA-Ⅰ的前8个氨基酸引入沉默突变,以pET-30b(+)为原核表达载体,在apoA-Ⅰ多肽链C-末端引入6×组氨酸标签,采用镍亲和层析对表达蛋白进行纯化。分别使用圆二色分析、浊度澄清试验和胆固醇外流试验对重组apoA-Ⅰ的α螺旋含量、脂质结合动力学及促细胞胆固醇外流能力进行评价。结果获得高表达产量的重组apoA-Ⅰ(12 mg纯化apoA-Ⅰ蛋白/L菌液);重组蛋白的α螺旋含量为(54±4)%,脂质结合动力学速率常数k1/2为0.059±0.002 min-1,胆固醇外流百分比为(16.68±1.77)%。结论可获得高产量并具有生物学活性的重组人apoA-Ⅰ;为构建apoA-Ⅰ其他突变体提供模式。

NF-κB在AngⅡ介导THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出及AB-CA1表达调控过程中的作用研究

目的:探讨核因子NF-κB活化对AngⅡ诱导的THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1基因表达、胆固醇含量的影响。方法:体外培养THP-1细胞以构建泡沫细胞模型,以AngⅡ和NF-κB活化抑制剂TPCK孵育细胞;以RT-PCR法、Western blot法测定THP-1源泡沫细胞ABCA1 mRNA和蛋白表达状态;采用酶法,通过荧光分光光度计检测细胞内胆固醇含量,应用液体闪烁技术仪检测胆固醇流出的变化;借助Sandwich ELISA法测定核因子NF-κB活化/核易位情况。结果:AngⅡ可即刻激活NF-κB表达活性,并导致干预24小时后泡沫细胞ABCA1 mRNA和蛋白表达下调;若预先用TPCK孵育,则TPCK可抑制AngⅡ对NF-κB的激活,且24小时后泡沫细胞ABCA1 mRNA和蛋白表达下调幅度减小。结论:AngⅡ能引起THP-1源性泡沫细胞胆固醇含量显著增高(P<0·05)、ABCA1表达显著减少(P<0·05)。机制可能与AngⅡ即刻激活NF-κB信号途径,早期活化的NF-κB可阻遏THP-1源泡沫细胞ABCA1基因和蛋白的表达,继而影响泡沫细胞内胆固醇的流出有关。

糖肾方抑制TGF-β1/Smad3通路促进小鼠肾小管上皮细胞胆固醇流出

目的:利用高糖诱导的小鼠肾小管上皮细胞(mouse tubular epithelial cells,mTECs)观察中药糖肾方颗粒及Smad3抑制剂SIS3对于TGF-β1/Smad3通路及细胞胆固醇流出通路的影响。方法:25 mmol/L高糖诱导mTECs细胞后,分别给予糖肾方及Smad3抑制剂SIS3干预,利用ELISA试剂盒检测细胞中脂质含量,利用Western blot和Real-time PCR检测细胞中TGF-β1/Smad3通路及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator 1α,PGC-1α)、肝脏X受体(liver X receptor,LXR)、ATP-结合盒转运蛋白A1(ABCA1)、ATP-结合盒转运蛋白G1(ABCG1)的表达。结果:糖肾方可以降低高糖诱导mTECs细胞中总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酸酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)含量,上调高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)含量(P<0.05);糖肾方及Smad3抑制剂SIS3可下调高糖诱导mTECs细胞中TGF-β1、Smad3、CollagenⅠ和Fibronectin的表达,上调PGC-1α、LXR、ABCA1、ABCG1的表达(P<0.05)。结论:糖肾方可通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路促进细胞胆固醇流出,减轻肾损害。

高密度脂蛋白介导大鼠皮肤成纤维细胞内胆固醇流出的机制

目的 研究高密度脂蛋白 3(HDL3 )介导大鼠皮肤成纤维细胞胆固醇 (ch)流出机制。方法 用N 乙酰咪唑修饰HDL ,阻断HDL与细胞受体相互作用 ,观察其对HDL3 介导细胞ch流出的影响。用FITC标记HDL示踪HDL3 在介导细胞ch流出中自身代谢过程。结果 牛血清白蛋白 (对照组 )介导 4.74%细胞ch流出 ,HDL3组和N 乙酰咪唑HDL组分别为 31 .85 %和 8.41 %。FITC HDL3 与细胞 37℃培养 3h后 ,细胞内吞荧光强度(FS)占细胞结合FS的 6 5 .78% ,其中 93.5 %FS存在于TCA可沉淀部分。细胞进一步 37℃培养 2h后 ,细胞释放FS占内吞Fs 80 .77% ,其中 92 .7%FS存在于TCA可沉淀部分。结论 HDL3 通过与细胞受体相互作用 ,介导细胞ch流出。其可能机制是HDL3 通过受体进入胞内 ,在胞内不经历溶酶体分解过程。它接受胞内ch后通过逆向胞饮形式流出胞外。