新型减毒HSV-2疫苗IFN-γELISpot检测方法的建立

通过比较不同刺激物、细胞培养时间、细胞接种浓度、免疫途径,建立检测新型减毒HSV-2疫苗细胞免疫水平的IFN-γELISpot方法。对C57BL/6小鼠进行减毒HSV-2疫苗免疫,第14天加强免疫,第21天分离小鼠脾脏淋巴细胞,采用IFN-γELISpot检测该疫苗的细胞免疫水平。结果表明:最佳实验孔刺激物为紫外灭活30 min、原滴度为10^(8)CCID_(50)/mL的疫苗全病毒颗粒,最佳细胞培养时间为24~48 h,最佳细胞接种浓度为3×10^(6)cells/mL,最佳免疫途径是皮下注射。实验建立了针对该疫苗的IFN-γELISpot方法,为该疫苗提供了一种检测细胞免疫水平的方法。

IFN-γ-ELISpot方法用于评价猪伪狂犬病疫苗免疫效果

鉴于常用的抗体检测方法不能完整反映免疫猪获得针对猪伪狂犬病毒的保护力,有必要建立猪伪狂犬病病毒(PRV)特异性IFN-γ的酶联免疫斑点检测(ELISpot)方法,并评估伪狂犬病疫苗细胞免疫的免疫效果。依照ELISpot基本操作流程,摸索PRV作为刺激原的最适浓度、外周血单个核细胞(PBMC)密度和作用时间以建立并优化该方法。将20头gB抗体检测阴性猪,随机分为单独弱毒疫苗免疫组、单独灭活疫苗免疫组、弱毒疫苗-灭活疫苗联合组及对照组,免疫后攻毒。利用所建方法,结合gB-ELISA、中和试验及攻毒保护试验,评价上述三种免疫程序的效果。试验结果表明:IFN-γ-ELISpot最佳条件为刺激原浓度2μg·孔^(-1)、外周血单核细胞(PBMC)浓度106·孔^(-1),培养时间36h。一免弱毒疫苗二免灭活疫苗组二免后2周,试验猪中和抗体效价可达1∶14.48,ELISpot斑点数可达(151.8±26.61)个·孔^(-1),且该免疫程序下,试验猪攻毒后体温、鼻拭子排毒及临床症状均低于其余试验组,攻毒8d后仅表现呼吸道症状;单独灭活疫苗免疫组二免后2周,试验猪的中和抗体效价可达1∶32.36,而ELISpot斑点数仅为(40.4±9.07)个·孔^(-1);单独弱毒疫苗免疫组二免后2周,试验猪的中和抗体效价仅为1∶1.36,但ELISpot斑点数可达(189.6±27.36)个·孔^(-1)。综合分析攻毒试验结果和ELISpot斑点数之间的相关性,本试验所建立的IFN-γ-ELISpot可用于猪伪狂犬病疫苗的细胞免疫评估,为免疫程序的评价和选择提供有效手段。

一种IFN-γ ELISPOT检测方法的建立

目的:建立检测一种融合蛋白疫苗诱导特异性细胞免疫的ELISPOT实验方法,通过分析免疫小鼠分泌IFN-γ的水平,评价疫苗诱导的细胞免疫应答效应。方法:以融合蛋白疫苗免疫C57BL/6小鼠,14天后加强免疫一次,于第28天无菌取脾,分离脾淋巴细胞,计数并调整细胞浓度,在已包被好的ELISPOT板中分别加入细胞悬液和刺激肽进行刺激培养。裂解细胞,依次加入酶标二抗、底物、显色液,在ELISPOT读板仪进行斑点计数和分析。结果:ELISPOT检测结果与动物免疫途径、细胞培养时间、细胞密度、肽浓度等条件密切相关。实验结果证明:采用皮下注射的免疫途径,免疫效果最佳;小鼠脾淋巴细胞浓度为4×105个/孔,加入1μg/孔的刺激肽刺激培养24～48小时的条件下,产生的特异性斑点数最多,本底干扰小,有利于结果判断。结论:实验建立了IFN-γELISPOT检测方法,可用于该融合蛋白疫苗细胞免疫研究。

鸡感染巨型艾美耳球虫后的体液、粘膜与细胞免疫应答

鸡的7种艾美耳球虫中，巨型艾美耳球虫免疫原性最强。为研究巨型艾美耳球虫激发宿主产生的免疫应答，我们检测了巨型艾美耳球虫3次感染后鸡只的抗体应答及细胞应答特征。ELISA检测显示，感染鸡只产生了显著高于未感染鸡只的特异性IgY和sIgA（肠道及胆汁）抗体；而酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测显示，被感染鸡只脾脏中分泌IFN-γ的球虫特异性淋巴细胞的数量显著高于对照组。粪便中卵囊的检测则显示，第3次感染后的鸡只几乎无卵囊排出，证实巨型艾美耳球虫产生的免疫应答可对同源感染提供完全的免疫保护。

SHIV-KB9感染中国源恒河猴后IFN-γ分泌性T细胞的反应分析

选取ELISPOT方法测定SHIV-KB9感染中国源恒河猴后PBMC中病毒特异性IFN-γ分泌细胞的频数.通过对4只动物的检测分析,发现记忆性T细胞分泌IFN-γ的能力与血浆中病毒载量呈负相关.但与印度源恒河猴相比,总体反应强度较弱,可能与中国源恒河猴遗传背景有关.由此为SHIV/中国源恒河猴模型的细胞免疫背景提供数据支持,也为今后利用此模型进行AIDS发病机制研究、药物筛选和疫苗评价奠定一定的基础.

汉滩病毒糖蛋白免疫反应性表位研究进展

汉坦病毒在我国主要导致肾综合征出血热,以高感染率、高病死率严重危害公共健康。由于灭活疫苗存在免疫效力欠佳和免疫靶标脱失等问题,近期研究方向主要聚焦蛋白的免疫反应性表位。表位是抗原分子的主要功能单位,可有效刺激机体的细胞免疫和体液免疫。随着免疫学和生物信息学技术的发展,研究具有免疫反应性抗原表位的技术不断完善。本文总结了近年来关于汉滩病毒糖蛋白表位的研究,从方法和应用2个方面进展进行简要综述,并总结当前表位研究所存在的问题,为肾综合征出血热的预防和治疗提供指导。

ELISPOT及FACS在慢性乙型肝炎病毒感染者细胞免疫功能检测中的应用

为探讨HBV感染者特异性细胞免疫功能的差异,选取以流感多肽刺激健康人外周血单个核细胞(PBMC),采用ELISPOT法检测其PBMC中IFN-γ分泌细胞的数量。在以流感多肽为刺激物建立的流感质控细胞库的调控下,以HBV核心抗原为刺激物,检测表面抗体阳性的HBV感染者(A组)、e抗原阳性的慢性HBV携带者(B组)、e抗原阴性的慢性HBV携带者(C组)三类研究对象的IFN-γ分泌细胞数量。同时,采用FACS方法对A、B、C组分别进行T淋巴细胞亚群及调节性T细胞(Treg)检测。发现A与B、C组相比,斑点形成细胞数(SFC)/106PBMC明显减少(P=0.000及P=0.022),C组斑点形成细胞数显著多于B组(P=0.000)。FACS检测结果A组CD4+T细胞数量及CD4/CD8比值A组显著高于B、C组,而Treg数量B组显著高于A、C组。表明通过ELISPOT及FACS对乙肝病毒感染者外周血T细胞进行数量上和功能上的研究,能够深入了解体机体的免疫状态,从而为临床治疗及判定疾病的发展、转归提供理论依据。

细胞免疫和遗传因素对乙型肝炎疫苗阻断母婴传播效果的影响

目的比较接种重组乙肝疫苗后不同体液免疫应答高危儿童的细胞免疫反应特点,进一步探讨母婴阻断失败、无应答的机理。方法124名母亲HBsAg和HBeAg双阳性的新生儿按常规乙肝的免疫程序接种重组CHO和酵母乙肝疫苗,于第1针免后3、7、12月检测HBsAg和抗-HBs,判定免疫成功或失败的新生儿,首针后60～120月(平均80月)再次检测HBsAg和抗-HBs指标,选取8名免疫重组乙肝疫苗母婴阻断失败儿童、4名免后无应答抗体反应的儿童和11名母婴阻断成功的儿童采集静脉血样,分离淋巴细胞,应用ELISPOT方法检测产生IL-2斑点形成细胞的数量,并对斑点数和表面抗体滴度的相关性进行比较,同时分析HLA-A、-B、DRB1和DQB1等位基因的多态性。结果(1)124名研究对象中有77．4％的儿童可产生保护性表面抗体,成功阻断母婴传播;13．7％的人免疫失败,感染乙肝;8．9％的儿童则对乙肝疫苗呈无应答状态。(2)免疫成功组产生IL-2细胞数(55．2±42．22)显著高于免疫失败组(3,75±3．24)和抗体无应答组(6．75±3．59),P<0．01。(3)儿童免疫乙肝疫苗后的表面抗体滴度与经乙肝疫苗诱导产生的特异性分泌IL-2的T细胞数量呈显著性正相关(r =0．601,P<0．01)。(4)HLA-B*48在对酵母乙肝疫苗无应答的儿童中占有25％的频率,显著高于免疫成功(2．2％)和失败的儿童(0％),P<0．05。对CHO疫苗无应答儿童的HLA-DRB1*15的频率显著高于免疫成功和失败的儿童(P<0．05)。结论乙肝疫苗母婴阻断失败和免后抗体无应答儿童的细胞免疫应答显著低于阻断成功的儿童,并且可能与遗传因素有关。

国产与进口重组酵母乙型肝炎疫苗免疫小鼠早期细胞免疫应答的比较

目的比较国产与进口重组酵母乙型肝炎疫苗免疫小鼠早期细胞免疫应答的差异。方法取批签发合格的国产疫苗1和2(酿酒酵母)、进口疫苗1(酿酒酵母)、国产疫苗3和4(汉逊酵母)、进口疫苗2(汉逊酵母)各3批,经背部皮下免疫BALB/c小鼠,3μg/(100μl·只),于免疫后7 d,处死小鼠,无菌取脾,制备脾细胞悬液,分离脾单个核细胞(mononuclear cell,MNC)。采用酶联免疫斑点(enzyme linked immunospot assay,ELISPOT)法测定小鼠MNC体外接受HBsAg刺激后产生的抗原特异性细胞因子IFNγ、IL-2、IL-4和IL-5水平及体外接受MHCⅠ类多肽S28-39刺激后产生的IFNγ水平。结果小鼠免疫酿酒酵母乙肝疫苗后,以HBsAg刺激MNC,国产疫苗1诱导产生的IFNγ、IL-2和IL-4水平均明显高于国产疫苗2和进口疫苗1,国产疫苗1和2诱导的IL-5水平均明显高于进口疫苗1(P均<0.05);以S28-39刺激MNC,3种疫苗诱导产生的IFNγ水平差异均无统计学意义(P>0.05)。小鼠免疫汉逊酵母乙肝疫苗后,以HBsAg或S28-39刺激MNC,进口疫苗2诱导的IFNγ和IL-4水平均明显高于国产疫苗3(P<0.05);3种汉逊酵母乙肝疫苗诱导的IL-2和IL-5水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论国产重组酵母乙肝疫苗诱导早期细胞免疫应答能力较好。

不同种类乙型肝炎表面抗原诱导小鼠早期细胞免疫应答的比较

目的 比较不同表达系统来源的乙型肝炎（乙肝）表面抗原（HBsAg）免疫小鼠诱导早期脾淋巴细胞抗原特异性细胞免疫应答的特点,探讨影响乙肝疫苗保护效果的因素.方法 3种HBsAg（汉逊酵母、CHO细胞和血源）分别皮下接种不同组小鼠（BALB/c,H-2d）,每只3μg,于免疫后4d分离脾单个核细胞（MNC）,经细胞分选仪（MACs）分选后,获得纯度高于90％的CD4＋和CD8＋T细胞,应用ELISPOT测定MNC、CD4＋和CD8＋T细胞体外刺激后所产生的细胞因子IFN-γ、IL-2斑点数（ SFC）.结果 细胞分选后,汉逊抗原诱导CD8＋T细胞分泌IFN-γ的水平和CD4＋T细胞分泌IL-2水平均显著高于CHO抗原组（8/10、2/10,P=0.035;6/10、0/10,P=0.005）.汉逊抗原组与血源抗原组CD8＋T细胞经体外刺激诱导IFN-y全部阳转（10/10）,但分泌水平上汉逊抗原组显著高于血源抗原组（t=2.479,P=0.035）；汉逊抗原组诱导CD4＋T细胞IFN-γ阳转率及分泌水平均显著高于血源抗原组（10/10、4/10,P=0.005；t=3.967,P=0.003）.结论 乙肝抗原免疫小鼠4d即可诱导细胞免疫应答,且汉逊酵母抗原早期诱导抗原特异性IFN-γ、IL-2的能力显著高于CHO和血源抗原,与其临床考核母婴传播阻断HBV保护率显著优于CHO和血源乙肝疫苗相一致,为及时接种乙肝疫苗的必要性和高危新生儿选择接种乙肝疫苗的类型提供依据.

乙型肝炎患者特异性细胞免疫功能检测的初步研究

目的通过酶联免疫斑点法检测乙型肝炎(乙肝)患者特异性细胞免疫功能,初步研究各型乙肝患者特异性细胞免疫功能的差异。方法选择急、慢性乙肝、肝炎肝硬化(乙型)、乙肝病毒(HBV)既往感染,接种乙肝疫苗后血清乙肝病毒学标志中仅表面抗体阳性及未接种过乙肝疫苗、未感染过HBV、血清HBV标志全部阴性者共6组研究对象,每组4例,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测其外周血单个核细胞中γ-干扰素分泌细胞的数量。结果急性乙肝患者、慢性乙肝患者及急性乙肝患者、肝炎肝硬化患者外周血单个核细胞γ-干扰素分泌细胞数量明显不同(P=0·0209及P=0·0211)。结论通过ELISPOT检测乙肝患者外周血单个核细胞γ-干扰素分泌细胞的数量可以了解乙肝患者特异性细胞免疫功能。急性乙肝患者特异性细胞免疫功能明显强于慢性乙肝患者及肝炎肝硬化患者。

HIV-1蛋白诱导T细胞产生IFN-γ反应特征及对HIV-1感染者病情进展的影响

目的探讨HIV—1特异性T细胞反应特征及对HIV-1感染者病情进展的影响。方法通过合成重叠肽技术及ELISPOT技术，采用队列研究方法对37名HIV-1感染者的病毒特异性T细胞免疫反应进行分析。结果83．78％（31／37）的HIV-1感染者对1个或多个合成肽反应（反应强度大于50SFU／10^6 PBMCs）HIV-1 B型病毒不同蛋白可激发HIV-1感染者的特异性T细胞反应，其中H1V-1 Gag蛋白被识别的频率最高，81％的HIV-1感染者识别HIV—1 Gag而且HIV-1 Gag蛋白诱导的T细胞反应强度最高，相对强度达到28．25％，明显高于其他蛋白，差异具有统计学意义（F=17．969，P〈0．001）；重叠肽诱导T细胞分泌IFN-γ反应频率、反应强度在HIV—1感染无症状期和艾滋病期无明显区别，但是HIV-1Gag蛋白诱导的T细胞反应强度在无症状期明显高于艾滋病期。结论HIV-1 B型病毒不同基因编码蛋白激发T细胞分泌IFN-γ反应不同，其中HIV—1 Gag蛋白特异性T细胞在控制病情进展方面发挥了重要作用。

ESAT-6/CFP-10/Rv3425/Rv3248c辅助诊断结核病的初探

用酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)评估新型复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3425/Rv3248c在活动性肺结核病诊断中的临床价值。选取初治肺结核患者血常规标本50例和健康体检者血常规标本40例,分别作为结核组和健康对照组,分离PBMC,应用新型复合ESAT-6/CFP-10/Rv3425/Rv3248c与ESAT-6/CFP-10融合蛋白作为抗原对受试者标本进行ELISPOT实验,检测两者斑点形成的细胞数量并进行比较。结果显示,复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3425/Rv3248c与ESAT-6/CFP-10融合蛋白检测结核分枝杆菌感染的阳性率依次为86%(43/50)、82%(41/50),特异度依次为82.5%(33/40)、85%(34/40)。研究表明,应用新型复合蛋白ESAT-6/CFP-10/Rv3425/Rv3248c作为抗原建立的ELISPOT法辅助诊断结核病具有较高的潜在应用价值。

结核分枝杆菌Ag85A在毕赤酵母中的表达、纯化及酶联免疫斑点试验研究

目的利用毕赤酵母表达和纯化结核分枝杆菌Ag85A蛋白,以期得到高效刺激T淋巴记忆细胞产生γ-干扰素的特异性抗原。方法用PCR扩增得到Ag85a基因,构建出重组质粒pPic9k-85a,通过电转化进入毕赤酵母,经遗传霉素G418抗性筛选、硫酸铵沉淀浓缩及离子交换层析纯化得到目的蛋白。最后以大肠杆菌和毕赤酵母表达的Ag85A分别为抗原刺激物进行酶联免疫斑点(Elispot)试验,分析其刺激BCG免疫小鼠T淋巴细胞产生γ-干扰素(IFN-γ)的能力。结果在毕赤酵母中成功克隆并稳定表达了Ag85A蛋白,Elispot检测结果表明,毕赤酵母比大肠杆菌产生的Ag85A蛋白,对小鼠T淋巴细胞的刺激效果更加明显(P<0.05),能产生更多的免疫斑点。结论毕赤酵母表达的Ag85A蛋白可以更高效的刺激T淋巴细胞,可用于检测结核杆菌感染诱导的细胞免疫应答。