罗非鱼无乳链球菌鉴定及基于cfb和16S rRNA基因同源性分析

为进一步阐明不同宿主不同地区无乳链球菌之间的关系,本研究从细菌形态学、生理生化、16SrRNA和cfb基因等方面,鉴定了2009—2011年广东、海南等地区的25株罗非鱼链球菌病原。同时结合全球不同宿主来源的84株链球菌16SrRNA基因序列,利用Modeltest3.7、MEGA3.0、MrBayes3.0b4进行综合系统发育分析。结果表明:2009—2011年罗非鱼链球菌病原均为无乳链球菌且它们在进化上聚为一个支系,说明2009—2011年广东、海南等地区罗非鱼无乳链球菌病原具有相同的起源。此外,罗非鱼无乳链球菌与法国人源、美国人源、牛源以及日本猪源等无乳链球菌均以高支持率(100)聚在一个支系,说明全球不同宿主来源的无乳链球菌亦具有相同的进化起源,同时也证明了中国罗非鱼无乳链球菌的潜在人畜共患性,这是国内首次对不同宿主无乳链球菌进行系统发育研究。

牛源性无乳链球菌分离鉴定及cfb基因的克隆和真核表达载体的构建

为研制奶牛乳房炎无乳链球菌的基因工程疫苗,采集隐性奶牛乳房炎奶样,利用THB(Todd-Hewitt Broth)固体选择培养基和色素试验,并结合无乳链球菌种属特异性基因cfb,采用PCR技术从隐性乳房炎奶样中分离和鉴定无乳链球菌。根据GenBank已报道的链球菌cfb基因序列,经ORF分析和B细胞表位预测,利用Primer 5.0软件设计cfb因子富含B细胞表位区域引物,添加酶切位点和真核表达元件,以分离株无乳链球菌的基因组为模板,PCR扩增cfb基因并连接T载体克隆测序,经测序确定无误后,连接pcDNATM3.1 V5-His A(pcDNA-cfb)真核载体,转化DH5α感受态细胞,提取重组质粒进行酶切和测序鉴定。结果显示,从89份隐性奶牛乳房炎奶样中分离得到8株无乳链球菌,成功构建了真核表达载体(pcDNA-cfb)。THB和色素试验初步筛选,可以作为快速分离无乳链球菌的一种方法,利用Bcepred和Lasergene-Protean软件对分离得到的无乳链球菌cfb基因序列分析,在所克隆的cfb基因序列内有多个优势抗原表位,因此,有望作为无乳链球菌基因工程疫苗研制的抗原靶标基因序列,为进一步研究其基因工程疫苗提供基础条件。

罗非鱼无乳链球菌的DIG-cfb原位杂交检测方法的建立

为建立一种批量检测罗非鱼无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的快速敏感的原位杂交方法,本研究依据罗非鱼无乳链球菌cfb基因序列,选取其132-599 bp之间的序列为靶序列,采用PCR法制备了特异性地高辛标记的DNA探针DIG-cfb(Digoxigenin-labelled cfb probe,430 bp),同时对所制备的探针进行了测序鉴定及特异性和敏感性检测。结果表明,探针测序序列与实际Gen Bank序列相符,所制备的DIG-cfb探针与无乳链球菌基因组杂交呈阳性,与患病罗非鱼的其他细菌病原(嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、类志贺邻单胞菌以及海豚链球菌)基因组,以及与无乳链球菌亲缘关系较近的链球菌其他种(牛源链球菌、变异链球菌),斑点反应则均为阴性,d NTP对照组也为阴性,表明该方法特异性强;该方法可实现对批量样品的快速检测,具有较高的灵敏度,可检测无乳链球菌基因组的下限为1.5 ng/μL DNA。对采集于广东、海南及广西等不同地点的无乳链球菌样品,均可获得较明显的斑点反应圈,对患链球菌病的罗非鱼肝、脑组织基因组也可特异的检测出无乳链球菌。表明本研究建立的DIG-cfb原位杂交法对无乳链球菌基因组的检测具有快速、特异、敏感等特点,适合罗非鱼无乳链球菌的批量检测。

齐口裂腹鱼无乳链球菌的分离鉴定及其感染的病理损伤

2012–2013年四川齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)养殖场流行一种临床特征为突眼、体表出血和神经症状的传染病,在肝、肾涂片检查中发现链状G+球菌。从自然发病齐口裂腹鱼分离到2株形态与涂片检查一致的G+球菌(DML120817,YZH130830),其在脑心浸液培养基(BHI)平板上28℃培养48 h,形成白色圆形、表面光滑、边缘整齐的针尖大小菌落。经人工感染实验证实分离菌株为该病的病原菌。根据分离菌株的形态学和生理生化检测结果初步判定其为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae);16S r RNA基因序列分析表明,2分离株(Gen Bank登录号分别为KF773744和KF761304)与Gen Bank中无乳链球菌(S.agalactiae)16S r DNA序列同源性达96.5%以上。在以分离菌16S r DNA序列(Gen Bank登录号分别为KF773744和KF761304)及其Gen Bank中同源性较高的链球菌16S r DNA序列构建的系统发育树上,分离菌与无乳链球菌聚为一族;同时在基于无乳链球菌cfb基因进行的特异性PCR检测中,分离菌均为阳性,进而鉴定2株分离菌为无乳链球菌。2株无乳链球菌对强力霉素、阿莫西林、先锋霉素V、氧氟沙星和左氧氟沙星等均敏感,但在新霉素与丁胺卡拉霉素上存在差异。病理学观察发现,无乳链球菌感染齐口裂腹鱼对多组织器官都造成明显的病理损伤,尤其是肝、肾、脑的损伤较为严重,表现为明显的变性、坏死以及炎症细胞浸润,且细菌侵入肝、肾、脾以及神经元细胞内,导致线粒体、内质网等细胞器损伤。

罗非鱼源γ溶血性无乳链球菌的分离鉴定

2012年9月5日广西柳州市某罗非鱼养殖场出现暴发性疾病,从患病罗非鱼的脑组织中分离到1株γ溶血性革兰氏阳性链球菌。通过生理生化试验、基于cfb基因的PCR鉴定及16S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为无乳链球菌。该菌株为γ溶血性,CAMP试验阴性,与常见无乳链球菌有较大差别。人工感染试验结果显示分离菌株对罗非鱼具有很强的致病性。药物敏感试验结果显示分离菌株对诺氟沙星、多黏菌素B、复方新诺明耐药,对青霉素G等17种药物均敏感。

红尾皇冠鱼(Aequidens rivulatus)病原无乳链球菌的分离、鉴定与特性分析

为查明天津地区养殖红尾皇冠鱼(Aequidens rivulatus)大量死亡的原因,取患病红尾皇冠鱼进行细菌分离,从病鱼肾脏中分离到优势菌株071901,人工感染试验证实其对红尾皇冠鱼有较强的致病性;采用形态学观察、生理生化特性、16S r RNA基因序列系统发育树分析及cfb(GBS-specific gene cfb,CAMP factor)基因检测对菌株071901进行鉴定。结果显示,菌株071901为革兰氏阳性球菌,生化特性与链球菌属的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)相近,基于16S r RNA基因序列的系统发育分析将菌株071901与无乳链球菌聚为一支,以071901为模板特异性扩增无乳链球菌的cfb基因,也得到了预期的900 bp的核酸片段,进一步证实菌株071901为无乳链球菌。对30种抗生素的药敏结果显示,菌株071901对红霉素、阿奇霉素等19种药物敏感,对多粘霉素、罗红霉素、呋喃唑酮等11种药物耐药。

红尾皇冠鱼无乳链球菌病LAMP检测方法的建立与应用

以cfb基因保守序列的6个区域设计4条特异性引物,利用链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温（65℃）下保温40 min,建立了无乳链球菌Streptococcus agalactiae的LAMP技术。建立的LAMP方法能够特异性地检测无乳链球菌,检测灵敏度为3.7×10^1～3.7×10^2cfu/mL,反应前加入显色剂钙黄绿素避免二次污染。现场应用中采用FTA卡采集红尾皇冠鱼Aequidens rivulatus病鱼肝脏组织病原菌,操作简便、快捷。研究表明,针对无乳链球菌cfb基因建立的LAMP检测方法具有较高的特异性及稳定性,尤其是具有快速、简便、成本低等优点,可用于无乳链球菌的野外现场快速检测。

罗非鱼无乳链球菌巢式PCR检测方法的建立

根据无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)cfb基因序列,设计、合成2对引物,优化扩增条件,建立了快速高灵敏度鉴别无乳链球菌的巢式PCR方法。结果显示:使用该方法对罗非鱼(Oreochromis mossambicus)血液样品进行检测,可检测到活菌浓度为8.7×104CFU/m L的无乳链球菌。对采自广西地区受无乳链球菌感染的19份罗非鱼样品进行检测,18份可获得目的片段,扩增到的序列均为无乳链球菌cfb基因序列,检测准确度达到94.7%。

贵州地区孕晚期妇女生殖道无乳链球菌定植筛查及CAMP试验阴性的GBS菌株基因测序分析研究

目的了解贵州地区孕晚期妇女泌尿生殖道无乳链球菌(GBS)定植状况及CAMP阴性菌株的鉴定分析。方法收集2016年5月~2017年5月贵州省人民医院产科门诊孕晚期妇女生殖道分泌物进行细菌培养、分离鉴定及药敏试验;通过生化试验及16SrDNA序列分析的方法对CAMP试验阴性的GBS菌株进行种属鉴定并检测其cfb基因。结果 3794例样本共分离出118株无乳链球菌,阳性率为3.11%;其中1株呈β-溶血且cfb基因检测阳性,但CAMP试验阴性,经16SrDNA序列分析确认为无乳链球菌;药敏结果统计未发现GBS对青霉素、阿莫西林、利奈唑胺、万古霉素、头孢噻肟、头孢吡肟耐药的菌株,耐药率较高的抗生素依次为红霉素(81.3%)、克林霉素(62.7%)、左氧氟沙星(72.9%)。结论CAMP试验阴性的无乳链球菌非常少见,3 794例样本中仅分离到了一株,因此临床实验室应警惕CAMP试验阴性的无乳链球菌,避免漏检,为临床提供更为准确的检测结果,并加强对GBS耐药性菌株的监测工作。

荧光PCR法在围生期孕妇B族链球菌筛查中的应用及CAMP试验阴性B族链球菌分子特征分析

目的:探讨荧光聚合酶链反应(PCR)在围生期孕妇B族链球菌(GBS)筛查中的应用价值及CAMP试验阴性GBS的鉴定分析。方法:收集产科门诊孕35~37周孕妇阴道/直肠拭子1143例,将拭子放入GBS增菌肉汤管增菌,分别用GBS显色平板和荧光PCR法检测GBS。16SrDNA分子鉴定技术对CAMP试验阴性GBS进行种属鉴定,并采用PCR技术检测其cfb基因。结果:显色平板检出146份阳性样本,阳性率为12.77%,荧光PCR法检出191份阳性样本,阳性率为16.71%,2种方法的阳性率差异有统计学意义(P<0.01);荧光PCR法与显色平板培养法相比,敏感性为93.15%、特异性为94.48%、符合率为94.31%。146株GBS中有10株为CAMP试验阴性,检出率为6.85%,均为cfb基因缺失株。结论:荧光PCR法可有效提高围生期孕妇GBS筛查的阳性率;该地区CAMP试验阴性GBS检出率较高,CAMP试验不宜作为GBS的鉴别试验,因存在缺失cfb基因GBS,GBS分子检测试剂不应选择该段基因设计引物。

基于cfb和scpb基因的无乳链球菌PCR检测方法比较及临床应用

目的比较基于cfb和scpb基因检测无乳链球菌(GBS)的两种PCR方法,建立合理的实时荧光PCR检测体系,实现快速检测生殖道无乳链球菌的目的。方法通过对60株临床分离的无乳链球菌和15株非无乳链球菌进行PCR扩增,对比和验证cfb和scpb基因的敏感性和特异性,选择检测性能更好的基因为靶标,建立实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测体系。对100份宫颈拭子、精液等常见临床标本进行检测,检测结果与传统的培养法进行比较。阳性率的比较采用卡方检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果cfb和scpb基因的特异性均为100%,敏感性分别为98.3%、66.7%,差异有统计学意义(P<0.005)。基于cfb基因的real-time PCR检测100份GBS临床样本的阳性率为35%,高于培养法(30%),差异无统计学意义,但这100份标本中有7份real-time PCR法扩增阳性但未培养出无乳链球菌。结论基于cfb基因的real-time PCR法检测GBS具有直接、快速、简便、高特异性等特点,且敏感性高于常规培养法,可应用于多种临床标本的检测,在临床上具有较大的应用前景。

广东与海南养殖罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定与特性分析

从中国广东、海南罗非鱼主养区发生爆发性疾病的多个养殖场的罗非鱼病鱼体上,分离到多株致病菌株。人工感染试验显示分离菌株具有较强的致病力,有多株经腹部注射分离细菌浓度为1×106CFU/mL时可使100%的受感染鱼死亡,选择其中7株强毒株进行药物敏感性实验与鉴定。不同菌株对药物敏感性存在一定的差异但与菌株来源无相关性,29种抗生素中对13种敏感、7种不敏感、9种存在菌株的差异。各分离菌株均为革兰氏阳性菌,呈β溶血。采用链球菌快速鉴定系统ID32STREP、Lancefield分析及多项补充生理生化鉴定结果,初步判断为无乳链球菌Streptococcus agalactiae。PCR扩增16S rRNA基因和GBS-specific gene cfb(CAMP factor)基因的全长序列,BLAST分析显示所有菌株的16S rRNA基因与GenBank上登录的无乳链球菌的相应序列高度同源(>99.8%),各分离菌株间的16S rRNA基因序列也高度同源(≥99.9%?100%)。各菌株cfb基因序列高度同源(100%),BLAST显示与已知无乳链球菌的相应序列也具有高度同源性(≥99.0%)。综合上述实验结果,可判定广东与海南罗非鱼主养区2009年夏季发生的罗非鱼爆发性疾病的病原菌为无乳链球菌。

罗非鱼源无乳链球菌双重PCR快速检测方法的建立

根据GenBank中罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖的cpsF基因和CAMP因子的cfb基因序列,设计2对特异性引物,通过对反应体系和反应条件优化,并进行特异性试验、敏感性试验及人工感染罗非鱼组织样品检测,建立了快速检测无乳链球菌的双重PCR方法。结果显示,仅无乳链球菌能扩增出cpsF和cfb两条特异性条带,而海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、鮰爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌无条带检出;经敏感性试验,最小模板检出量为7.632×10-2ng/μL;同时对30尾人工感染无乳链球菌的罗非鱼肝和肾组织中细菌DNA进行双重PCR检测和细菌分离鉴定,检出的阳性结果一致。证实,所建立的方法具有快速、特异、灵敏的优点,适用于对罗非鱼等无乳链球菌的感染病例进行流行病学监测。

奶牛乳房炎无乳链球菌的分离及PCR鉴定

利用THB(Todd-Hewitt Broth)固体培养基和色素试验培养基选择培养无乳链球菌,参照GenBank中无乳链球菌参考菌株(Accession:AF015927.1、JQ289582.1)16SrRNA和种属特异性基因cfb(CAMP因子)序列设计引物,对奶样中分离的12株疑似无乳链球菌进行鉴定。结果显示,经PCR扩增后,被检测的12株细菌均可扩增出预期大小的16S rRNA基因序列,而12株中有8株可以扩增出预期大小的cfb基因序列,条带单一,特异性好。序列BLAST显示,12株菌的16S rRNA基因序列与NCBI上报道的无乳链球菌相应序列高度同源(>99.0%),各分离菌株间的16S rRNA基因序列也高度同源(99.0%～100.0%);cfb基因序列与NCBI上已报道的无乳链球菌相应序列具有高度同源性(>99.0%),各菌株间cfb基因序列也高度同源(100.0%)。经选择培养与PCR鉴定结果可以确定12株疑似菌株中有8株为无乳链球菌。