多重耐药基因cfr在广东地区猪源肠球菌中的流行特点

为调查多重耐药基因cfr在广东地区猪源肠球菌中的流行特点及分离株对临床常用药物的耐药情况,本研究通过对临床分离的8株携带cfr基因的肠球菌进行最小抑菌浓度(MIC)测定,脉冲凝胶电泳(PFGE)分型和southern杂交定位,确定分离株的耐药表型和cfr基因在肠球菌中的传播方式。研究表明,8株菌对氟苯尼考、庆大霉素和红霉素耐药率均为100%;对四环素、环丙沙星和利福平的耐药率高达75.0%以上。PFGE结果显示在同一猪场分离的28株cfr阳性肠球菌共有8种不同的PFGE谱型,表明cfr基因在同一猪场中存在克隆传播的现象。Southern杂交结果显示,cfr基因在6株菌中定位于20 kb^50 kb的质粒。本研究为临床制定合理措施控制cfr快速传播提供实验依据。

cfr基因介导的耐利奈唑胺头状葡萄球菌及其同源性研究

目的 调查利奈唑胺耐药头状葡萄球菌临床株携带的cfr基因及其同源性。方法 收集2018年6月-2019年10月分离自ICU患者血液标本的9株利奈唑胺耐药头状葡萄球菌。菌株的鉴定和药敏使用VITEK 2Compact仪器;cfr和optrA基因通过PCR扩增和测序确认;基于高通量测序平台获得头状葡萄球菌QD40株的染色质和携带的质粒序列,并用软件分析菌株的生物学信息;脉冲场凝胶电泳(PFGE)检测菌株之间的同源性。结果 9株头状葡萄球菌呈现多重耐药表型,且都携带cfr基因,但未检测到optrA基因。高通量测序显示头状葡萄球菌QD40株携带三个质粒(分别命名为pQD40-1,pQD40-2和pQD40-3)。其中,质粒pQD40-3大小为39 504bp,携带cfr基因。PFGE显示这9株菌的电泳条带图谱完全一致。结论 头状葡萄球菌临床株对利奈唑胺耐药的分子机制是与其携带cfr基因有关。另外,ICU病房中存在cfr基因介导的耐利奈唑胺头状葡萄球菌感染的暴发流行,应引起临床重视。

鸡源葡萄球菌携带cfr与tet(M)基因于同一质粒的检测

为了解鸡源葡萄球菌中多药耐药基因cfr的流行及耐药情况,采用提取细菌基因组DNA、PCR检测、药物敏感性检测、质粒提取、电转化试验、全质粒测序及分析等方法进行了研究。分离并鉴定出了1株多药耐药表型葡萄球菌,其含有cfr与tet(M)基因,且cfr与tet(M)耐药基因位于同一质粒上。

金黄色葡萄球菌临床株对利奈唑胺耐药性及耐药机制

目的了解金黄色葡萄球菌(金葡菌)临床株对利奈唑胺耐药性及耐药机制。方法收集2011-2014年浙江省人民医院900株金葡菌,采用纸片扩散法测定利奈唑胺药敏,对筛选到的耐药菌株采用琼脂稀释法测定常用药物的最低抑菌浓度(MIC),同时对其耐药基因cfr、optr A、23S r RNA基因第5功能区进行PCR扩增和序列分析。对cfr或optr A基因阳性的菌株进行基因周围序列分析和菌株多位点序列分型(MLST)。结果临床分离金葡菌对利奈唑胺耐药率为0.1%(1/900),仅发现1株耐药株,该菌株为耐甲氧西林金葡菌(MRSA),对利奈唑胺MIC为8 mg/L、头孢西丁48 mg/L、青霉素32 mg/L、环丙沙星128 mg/L、克林霉素32 mg/L、氯霉素128 mg/L、万古霉素0.75 mg/L、替考拉宁0.5 mg/L。除万古霉素和替考拉宁,对其他抗菌药物均耐药。PCR结果显示该菌株cfr基因为阳性,optr A阴性,无23S rRNA突变。该菌株携带的cfr基因位于"Tn4001-like转座子-cfr-orf1-ISEnfa4"复合转座子中,并定位于一个39 504 bp的质粒上。该菌株的MLST分型为ST5。结论临床分离金葡菌对利奈唑胺耐药率低,发现1株cfr基因介导的利奈唑胺耐药株,cfr基因位于质粒上一个常见的复合转座子中。

利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌耐药机制分析

目的调查临床分离金黄色葡萄球菌对利奈唑胺的耐药情况及耐药机制。方法用Vitek 2系统GP67卡对2019年1月至12月南京鼓楼医院临床分离905株金黄色葡萄球菌进行药敏试验,对检出的利奈唑胺耐药菌株用E-test法复测利奈唑胺最低抑菌浓度(MIC);用PCR扩增及测序技术分析利奈唑胺耐药决定基因cfr、optr A及23S rRNA基因V区;对菌株基因组DNA进行全基因组测序分析,对耐药基因、毒力基因进行生物信息学分析;用多位点序列分型(MLST)技术获得菌株ST分型。结果 905株金黄色葡萄球菌检出1株(0.1%)利奈唑胺耐药株(MIC为16 mg/L),该菌株除对万古霉素和复方磺胺甲噁唑敏感外,对其余常用抗菌药物均耐药。PCR及测序技术显示该菌株携带cfr基因,23S rRNA V区存在T2337G和C2370G核苷酸突变位点;全基因组序列分析显示基因组包含碱基数为2 949 411 bp,总基因数为3 023个,包含59个tRNA编码基因以及7个完整的rRNA基因编码操纵子,获得Gen Bank登录号JAANYO000000000,且该菌株携带包括cfr在内的多种耐药决定基因和毒力基因;MLST分型为新型ST5985。结论利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌临床分离率较低。检出由cfr基因和23S rRNA V区突变介导的新ST型利奈唑胺耐药株。

利奈唑胺耐药肠球菌耐药机制分析

目的探讨利奈唑胺耐药肠球菌的相关耐药机制。方法对临床分离到的10株利奈唑胺耐药肠球菌,分别提取基因组DNA及质粒DNA,采用PCR技术分别扩增23S rRNA的V583区片段、编码核糖体蛋白的L3、L4基因片段及cfr基因片段。阳性扩增产物进行测序并与标准菌株ATCC 29212进行比对,分析有无突变点。结果 10株利奈唑胺耐药肠球菌均PCR扩增出V583区、L3、L4目的基因,测序未检测到23S rRNA的V583区域发生点突变G2576T以及L3、L4基因突变所引起氨基酸序列的改变。10株细菌均未检测到cfr基因。结论我院分离的肠球菌未发现利奈唑胺耐药机制G2576T突变,L3、L4基因突变导致氨基酸序列改变及多重耐药基因cfr基因的存在,推断利奈唑胺耐药肠球菌仍存在未知的耐药机制。

粪肠球菌对利奈唑胺低水平耐药机制的研究及同源性分析

目的研究4株临床分离的利奈唑胺低水平耐药粪肠球菌的耐药机制及同源性。方法收集临床分离的利奈唑胺耐药粪肠球菌4株,采用微量肉汤稀释法确认菌株对利奈唑胺最低抑菌浓度(MIC);PCR扩增和测序检测23S r RNA V区基因、核糖体蛋白L3和L4编码基因(rplC、rplD)及多重耐药基因cfr和新型耐药基因optrA。多位点序列分型(MLST)分析菌株同源性。结果4株粪肠球菌对利奈唑胺MIC值均为8μg/ml,均为低水平耐药,23S r RNA V区基因、核糖体蛋白L3和L4编码基因均未发现任何位点突变,未检测到cfr基因,但均携带optrA基因。MLST分型显示4种ST型,分别为ST476、ST16、ST116、ST75。结论初步推断携带optrA基因与粪肠球菌对利奈唑胺呈现低水平耐药有关,耐药菌株在本院呈散发。

广东不同地区葡萄球菌cfr基因的流行性调查

编码23SrRNA甲基化酶的cfr是多重耐药基因,它不仅介导细菌对截短侧耳素类药物耐药,而且也影响其他作用于PTC的药物,包括氯霉素类、林可胺类、噁唑烷酮类、链阳菌素A。cfr基因多次在动物及人医临床中分离到的葡萄球菌中发现。为了了解2013年广东省不同地区猪场中葡萄球菌的耐药情况和cfr基因流行情况,探讨耐药菌株克隆传播的可能性。采用PCR检测cfr、gap基因以及16SrRNA基因测序来鉴定葡萄球菌,用琼脂稀释法测定36株cfr基因阳性葡萄球菌对12种抗菌药的敏感性,并经SmaⅠ酶切、PFGE技术来分析菌株之间的亲缘性。结果显示,2013年从猪场采集的样品中分离出1 049株菌株中有36株携带cfr基因的葡萄球菌,分别是2株来源于人的葡萄球菌和34株来源于猪的葡萄球菌,其中19株松鼠葡萄球菌、5株腐生葡萄球菌、4株科氏葡萄球菌、3株阿尔莱葡萄球菌、1株木糖葡萄球菌、1株金黄色葡萄球菌和3株葡萄球菌属,其中23株也携带fex(A)基因。36株cfr基因阳性菌对四环素、氨苄西林、克林霉素、头孢噻呋、氟苯尼考的耐药率分别是83.33%,77.78%,77.78%,75%,75%,对环丙沙星、利奈唑胺相对敏感。PFGE图谱完全相同的菌株有328和371,251和283(其中菌株328和371来自于同一养殖场,菌株328来源于猪的腐生葡萄球菌,菌株371来源于人的腐生葡萄球菌)。2013年广东省不同地区猪场cfr基因检出率为9.15%,36株cfr基因阳性菌对12种兽医临床常用药物耐药较严重,提示人与猪之间存在cfr基因阳性菌株的克隆传播。

可介导多药耐药的cfr基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为建立监测Cfr蛋白的方法奠定基础,采用PCR方法扩增cfr基因,并克隆入pEasy-T载体;测序确认后克隆入pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a-cfr,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中并用IPTG诱导表达Cfr蛋白;用纯化的Cfr蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并对抗体进行鉴定。结果显示,成功克隆了全长cfr基因,构建了重组质粒pET-28a-cfr,并诱导了Cfr蛋白表达以及制备了小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体;Western-blot法鉴定该抗体可特异性识别重组蛋白Cfr;ELISA法测定抗体效价为1∶64 000。结果表明,用大肠杆菌BL21(DE3)能够成功表达Cfr蛋白,并且获得了高特异性、高效价的小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体。

广东省猪源葡萄球菌耐药性分析及多重耐药基因cfr的流行现状

为了解2013-2017年间广东省猪源葡萄球菌的耐药情况及多重耐药基因cfr的流行现状,采集生猪养殖场和交易市场猪鼻腔拭子分离葡萄球菌,采用琼脂稀释法测定分离菌株对14种抗菌药物的敏感性,并用PCR检测mecA和cfr基因的携带情况。结果显示,在采集的4099份样品中分离到葡萄球菌1485株,其中金黄色葡萄球菌173株。猪源葡萄球菌对红霉素、四环素、泰妙菌素、克林霉素、沃尼妙林和氟苯尼考耐药严重,耐药率分别为91.0%、90.2%、87.7%、84.6%、84.6%及82.0%,对利福平和利奈唑胺相对敏感,未发现万古霉素耐药菌株;庆大霉素、四环素、红霉素和环丙沙星的耐药率呈现逐年上升的趋势。在1485株葡萄球菌中,mecA和cfr的检出率分别为39.9%和12.3%。cfr阳性菌株常携带多种耐药基因,cfr基因的遗传背景也呈现多样化。结果表明,广东省猪源葡萄球菌的耐药情况严重,cfr的检出率高,应加强养殖业中抗菌药物的规范和合理使用,减缓耐药性的产生和传播。

细菌耐药基因cfr的研究进展

随着抗菌药物在兽医临床的广泛使用,耐药菌株数量逐年上升,使耐药机制成为研究热点。耐药基因cfr(chloramphenicol-florfenicol resistance)可编码合成细菌的23S rRNA甲基化酶,该酶可影响抗菌药物与转肽酶结合,使细菌产生耐药性。而携带cfr基因的菌株可对氯霉素类、林可酰胺类、截短侧耳素、链阳菌素A和恶唑烷酮类五大类常用抗菌药物耐药,使细菌产生多药耐药。因此耐药基因cfr的作用机理和传播机制的研究是细菌耐药性研究的关键。对多重耐药基因cfr的发现、危害、耐药机制及其在不同类型菌体中的传播机制和流行情况进行综述,讨论了目前研究中存在的问题,并对未来的发展提出建议,可为进一步建立cfr基因检测网、新药研制和阻断cfr基因的传播提供参考和依据。

多重耐药基因cfr在食品动物源大肠杆菌中流行特点的调查

为调查多重耐药基因cfr在我国多个地区食品动物源大肠杆菌中的流行情况及耐药现状,对2014年从广东、山东、江苏等11个省份分离得到的4 702株大肠杆菌,采用PCR和测序方法验证cfr阳性菌株,并通过临床常用药物敏感性测定、脉冲场凝胶电泳分型（PFG E）和Southern杂交定位等方法,确定分离株的耐药表型和cfr基因在大肠杆菌中的传播方式。结果显示,共检出cfr阳性菌株9株,检出率为0.19%。药敏试验结果显示,9株cfr阳性菌株对氯霉素、氟苯尼考、氨苄西林、四环素、多西环素均耐药,对亚胺培南均表现为敏感,对庆大霉素、新霉素耐药率在60%以上,对其他药物耐药率介于10%~50%之间。PFGE结果显示,有2株来自同一养殖场的菌株谱型相似,表明存在克隆传播。Southern杂交结果显示,cfr基因定位于大小为70~400 kb之间的质粒上。上述调查结果表明,多重耐药基因cfr在食品动物源源大肠杆菌中的检出率较低,但在广东地区较为流行。

致病性葡萄球菌cfr基因介导的多重耐药机制研究进展

葡萄球菌是临床常见致病菌及食源性致病菌,可在食品原料加工、包装及运输过程中污染食品,引起人体多种严重感染,其耐药性的不断增强对公共卫生安全产生了重大的威胁。葡萄球菌中cfr(chloramphenicol-florfenicol resistance)基因编码的甲基转移酶,可引起细菌核糖体RNA的甲基化,从而阻碍或减弱多种化学结构不同的抗生素与肽基转移酶活性中心(peptidyl transferase center,PTC)的结合,导致葡萄球菌多重耐药表型的出现。噁唑烷酮类药物-利奈唑胺是继万古霉素后治疗耐药革兰氏阳性菌所致感染的最后一道防线,cfr基因的出现大大加速了利奈唑胺耐药性的传播。cfr基因广泛分布于多种致病性葡萄球菌中,cfr基因与各类型可转移元件(质粒、转座子和整合相关元件等)密切关联的遗传环境是其广泛传播的结构基础。在cfr基因水平传播的过程中,食源性致病葡萄球菌作为中间者扮演着重要的角色。本文就近年来国内外对致病性葡萄球菌中cfr基因的分布状况、耐药机制、遗传环境、传播机制等进行综述,以期为防控致病性葡萄球菌的传播提供参考,以遏制多重耐药菌的进一步传播。

杭州地区耐甲氧西林表皮葡萄球菌对利奈唑胺耐药机制研究

目的：了解杭州地区耐甲氧西林表皮葡萄球菌（ MRSE）临床菌株对利奈唑胺耐药机制。方法2013年5月—2015年4月从杭州地区多家医院败血症、泌尿道感染、感染性胸膜炎患者标本中分离出23株对利奈唑胺耐药表皮葡萄球菌（ LRSE ）。采用 E-test测定13种抗生素对上述LRSE菌株的最低抑菌浓度（ MIC）。采用脉冲场凝胶电泳（ PFGE）和聚类分析确定上述LRSE菌株的同源性。采用PCR及其产物测序了解上述LRSE菌株23S rRNA 基因第5功能区G2576T突变和cfr基因与利奈唑胺耐药的关系。结果23株LRSE中,15株利奈唑胺MIC〉256μg/ml,8株利奈唑胺MIC分别为6或8μg/ml,但均对苯唑西林和头孢西丁耐药。利奈唑胺高耐药（ MIC〉256μg/ml） LRSE菌株中,LRSE1和LRSE2、LRSE3~LRSE6、LRSE9~LRSE12分别为来自同一医院的同一克隆系。所有LRSE菌株均携带cfr基因,但利奈唑胺高耐药（ MIC〉256μg/ml）的15株LRSE菌株同时存在23S rRNA基因第5功能区G2576T突变,但利奈唑胺低耐药（ MIC=6或8μg/ml）的8株LRSE菌株则否。结论本地区分离的LRSE菌株对利奈唑胺耐药水平差异较大,但分布较广且均为耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌。 LRSE对利奈唑胺耐药性与其23S rRNA基因第5功能区G2576T突变和携带cfr基因有关。

猪源葡萄球菌中氟苯尼考耐药基因及其移动元件检测分析

氟苯尼考是一种特效动物专用抗菌药,随着临床用药量加大,其耐药菌株的数量也呈逐年上升的趋势,因而其传播机制亟需研究。收集新疆乌鲁木齐市周边养殖场的猪直肠和鼻腔样品,采用琼脂稀释法对样品中分离出的葡萄球菌进行临床9种常用抗菌药物的药敏试验,通过PCR方法对耐氟苯尼考的葡萄球菌进行耐药基因cfr、fexA和fex B的检测和物种鉴定,并对引起其传播的插入序列IS21-558和Tn558转座酶基因进行检测分析,探究引起上述耐药基因在菌群间可能的传播机制。结果显示鼻腔和直肠分离的葡萄球菌对克林霉素和氧氟沙星的耐药率较高,而对庆大霉素耐药率较低;鼻腔葡萄球菌主要以6耐(19.9%)和7耐(19.9%)为主;而直肠葡萄球菌主要以8耐(27.1%)为主;直肠葡萄球菌比鼻腔葡萄球菌耐药情况更加严重。筛选出两株均携带cfr和fexA基因的葡萄球菌,分别鉴定为松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)和木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus),1株携带fexA基因的葡萄球菌鉴定为腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus),未检出携带fex B基因的菌株。通过PCR扩增发现3株阳性菌携带部分IS21-558移动元件基因和Tn558转座酶基因,可能会增加cfr和fexA基因的水平传播风险,使多药耐药细菌的产生成为可能。本研究揭示应加强畜牧兽医临床对cfr和fexA基因的检测和监测工作,为进一步分析阳性耐药菌株的传播和流行提供基础数据。

我国临床分离葡萄球菌对利奈唑胺敏感性下降的机制研究

目的研究我国2017-2018年度临床分离葡萄球菌对利奈唑胺敏感性下降的机制。方法用琼脂二倍稀释法测定葡萄球菌对抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC),提取利奈唑胺MIC处于敏感上限的菌株(MIC≥4μg·mL-1)的DNA,用聚合酶链反应扩增利奈唑胺耐药基因、核糖体23SrRNA、核糖体L蛋白,并对聚合酶链反应产物进行测序和分析。结果 2017-2018年度利奈唑胺MIC≥4μg·mL-1的葡萄球菌有39株,其中34株为金黄色葡萄球菌,5株为头状葡萄球菌。5株头状葡萄球菌核糖体23SrRNA均发生G2576T突变;有1株金黄色葡萄球菌和2株头状葡萄球菌携带cfr基因;在15株菌株中检测到L蛋白突变。结论核糖体23SrRNA突变和cfr基因是导致利奈唑胺敏感性下降的主要机制,利奈唑胺敏感性下降需引起重视。