鸡骨保护素(chOPG)的原核表达、纯化及抗体制备

【目的】骨保护素(OPG)是一种新发现能抑制前体破骨细胞分化及成熟破骨细胞活性的蛋白,本文旨在从体外扩增、表达鸡骨保护素(chOPG)蛋白,并制备其多克隆抗体,为深入研究它的生物学功能奠定基础。【方法】以体外培养的鸡胚成骨细胞中提取的总RNA为模板,利用RT-PCR方法,扩增出chOPG基因,测序后克隆至原核表达载体pET-32a(+),成功构建了原核表达质粒pET-32a(+)-OPG,重组质粒转化Rosetta-gami(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达。【结果】表达产物经SDS-PAGE电泳,发现目的蛋白大小约为63kD,占菌体总蛋白的11.9%,Western blotting分析显示,表达的chOPG蛋白具有良好的免疫反应性。用镍离子亲和层析的方法可获得纯化的蛋白,以纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA结果显示效价达到1﹕10240。Western印迹结果表明,该抗体可以和chOPG酵母表达产物特异性结合。【结论】成功地实现了鸡骨保护素在大肠杆菌中的表达,并获得其多克隆抗体。

chOPG RNA探针的制备及其在鸡骨组织的原位杂交

目的制备地高辛标记的禽OPG cRNA探针。方法将目的片段重组到T载体中,构建chOPG/pGM-Teasy重组质粒,EcORI酶切鉴定并测序验证。分别用SalI和NcoI进行酶切得到线性化DNA模板,用Sp6和T7 RNA聚合酶体外转录合成地高辛标记的正反义RNA探针。运用斑点杂交的方法检验探针的标记效率,并通过骨组织原位杂交反应进一步检测探针标记是否制备成功。结果成功构建出chOPG/pGM-Teasy质粒。结论获得的高效正、反义chOPGRNA探针,为进一步研究OPG在蛋鸡各组织中的表达奠定基础。