异黄酮合成代谢调控关键酶CHS、CHI的特性与研究前景

查尔酮合酶(Chalcone synthase,CHS)与查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是异黄酮合成途径中的两个关键酶,它们在植物中的表达效率直接影响到异黄酮的产量。本文综述了植物CHS、CHI的功能、特性、基因结构、进化以及基因表达调控等方面研究的新进展,并对CHS、CHI研究的应用前景进行了展望,在此基础上提出了从根本上提高异黄酮产量的可行途径以及一些亟代解决的问题。

甘蓝型油菜BnCHI-1基因的克隆和表达特征分析

为了解Bn CHI-1基因的表达与粒色差异之间的关系,采用RACE技术从甘蓝型油菜黑籽系5B中克隆了Bn CHI-1全长c DNA序列和基因组序列。Bn CHI-1的DNA序列为1 809bp。965bp的Bn CHI-1 mRNA含有一个756bp的ORF,编码包含251个氨基酸的多肽。预测发现Bn CHI-1蛋白存在查尔酮-黄烷酮异构酶结构域,底物2S-柚皮苷的结合位点以及氢键网络氨基酸残基活性位点。Southern杂交结果表明在甘蓝型油菜中有6个CHI基因成员。RT-PCR揭示,甘蓝型油菜5B的11个器官组织均有Bn CHI转录,其在茎、叶、蕾和花中的转录水平比较高,其次为种子和根,在子叶中最低。比较1对近等基因系(黑籽系L1和黄籽系L2)中Bn CHI转录水平,发现在花蕾、花、花后20d种子和花后30d种子中,二者的转录水平没有显著差异,但在开花后10d的种子中,L2中Bn CHI转录水平显著低于L1中Bn CHI转录水平。

矮牵牛查尔酮黄烷酮异构酶(chiA)基因启动子的克隆和测序

通过PCR扩增，从矮牵牛中克隆了能在花瓣、花药、花粉中特异表达的查尔酮黄烷酮异构酶（chiA）基因启动子，序列分析表明，该启动子含1305个核苷酸，与国外报道的序列完全一致。

芍药查尔酮异构酶基因CHI的表达特性分析

为了揭示查尔酮异构酶基因(chalcone isomerase gene,CHI)在芍药花瓣中的表达规律与特点,以不同芍药托桂型品种(‘金辉’‘彤云金焰’‘红楼锦菊’)4个不同发育时期(花蕾期、初开期、盛开期、衰败期)中的内、外花瓣为对象,用qPCR分别检测CHI基因的表达水平,分析其在不同芍药品种、不同发育时期以及内外花瓣之间的表达差异。结果显示:不同发育时期同一品种芍药花瓣组织CHI基因的表达量存在一定差异,从花蕾期到衰败期整体表现为上升趋势;不同品种同一发育时期‘彤云金焰’花瓣组织(内瓣和外瓣)CHI基因的表达水平明显高于‘金辉’和‘红楼锦菊’的;同一芍药品种在相同发育时期内瓣组织的CHI基因表达量均明显高于外瓣组织的。鉴于不同芍药品种、不同发育时期内外花瓣间颜色存在差异,推测CHI基因表达量可能与芍药花瓣颜色的形成有关。该结果可为深入研究芍药CHI功能并开展芍药花色遗传改良分子育种研究提供技术支撑。

CiCHI提高拟南芥总黄酮含量

查尔酮异构酶(CHI)是类黄酮合成途径中的第二个关键酶,对调控整个代谢途径起着重要作用,明确该基因功能,为进一步揭示中间锦鸡儿的抗逆机制提供理论依据。根据已知CHI基因的保守结构域设计简并引物,以中间锦鸡儿cDNA为模板,克隆得到CiCHI全长,并通过序列分析、系统进化分析进行确认。qRT-PCR检测分析发现,中间锦鸡儿CiCHI的表达受到紫外、NaCl、ABA等胁迫诱导。CiCHI在叶中表达量最高,茎中次之,根中最少。异源表达CiCHI使拟南芥的总黄酮含量明显增加。

化橘红黄酮类生物合成中功能基因的克隆与序列分析

目的:克隆获得广东道地药材化橘红黄酮类化合物生物合成中几个重要功能基因。方法:利用CTAB-LiCl法提取高质量的化橘红总RNA,采用RT-PCR技术克隆基因。结果:克隆获得了化橘红黄酮类生物合成中三个重要功能基因,它们分别为查尔酮合成酶基因,该基因编码区全长1173 bp,编码391个氨基酸,NCBI序列登录号:GQ892059;黄烷酮-3-羟化酶基因,该基因编码区全长1 086 bp,编码362个氨基酸,登录号:GU323284;查尔酮异构酶基因,该基因全长666 bp,编码222个氨基酸,登录号:GU323285。结论:CTAB-LiCl法能提取高质量的化橘红总RNA,克隆获得的三个功能基因都具有开放阅读框。

荔枝果皮中4种酚类代谢酶活性的测定方法

为了改进酚类物质生物合成途径中关键酶酶活性的测定方法,以南方重要常绿果树荔枝Litchi chinensis果皮为材料,采用两点法和酶动力法2种酶活性研究方法,结合分光光度法和高效液相色谱法检测产物浓度变化,优化了4种酚类代谢常见酶[包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查儿酮异构酶(CHI)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)和类黄酮糖基转移酶(UFGT)]的测定方法,指出了酶液的纯化、酶活性的保护以及反应底物的溶解方法等对试验结果的稳定性和可靠性的影响,介绍了试验过程中常遇到的问题和具体的解决方法以及试验过程中的注意事项.应用改进后的方法测定荔枝发育过程中果皮PAL、CHI、DFR和UFGT的酶活性,结果发现活性变化趋势与前人的报道基本一致.改进的PAL、CHI、DFR和UFGT酶活性的测定方法可靠,可为相关的研究提供重要的参考.

油菜查尔酮异构酶基因的克隆及SNP分析

类黄酮是一种重要的植物次生代谢产物,查耳酮异构酶(CHI)是类黄酮生物合成早期阶段的一个关键酶,在种皮发育和颜色形成过程中具有重要的调控作用。为深入研究CHI基因在种皮发育和颜色形成中的作用及生物学功能。以16份三大类型黄、褐籽油菜为试验材料,采用同源克隆法克隆得到CHI基因的序列,并进行分子进化分析。将克隆得到的序列利用NCBI在线软件预测ORF Finder分析该基因的开发阅读框(ORF),结果发现,CHI基因ORF长度为756 bp或759 bp,编码251个或252个氨基酸。利用DNAMAN(v5.0)软件进行序列同源比对分析结果表明,CHI基因在三大类型油菜中的同源率为96.41%;利用NCBI在线软件CDD预测其保守结构域,发现它们都具有查尔酮超家族保守结构域。利用MEGA 5.2软件进行系统进化分析,结果表明,CHI基因在白菜型油菜与甘蓝型油菜中亲缘关系较近,与芥菜型油菜亲缘关系较远,并发现油菜与萝卜、拟南芥的CHI亲缘关系较近。比较三大类型油菜中黄籽油菜与褐籽油菜中CHI基因序列,结果发现,该基因在第202(C/A)位核苷酸处存在差异,可导致第68位氨基酸(P/T)的差异,这可能与油菜种皮的颜色的变化有关。该研究揭示了CHI基因的特征,为阐明CHI基因在油菜种皮颜色形成过程中的作用机制及其功能特征奠定基础。

三色堇花色素合成途径中部分结构基因的克隆及生物信息学分析

【目的】对三色堇花色素合成的3个结构基因VwCHS、VzvCHI和VwF3H进行克隆以及生物信息学分析。【方法】利用RAcE／PcR技术克隆得到VwCHS、‰cHf和VzvF3H基因的全长序列，并通过在线分析软件对其生物信息学进行分析。【结果】获得VwCHS、VwCHI和VwF3H的cDNA全长分别是1481，975和1361bp；经多重序列比对发现这3个基因编码的氨基酸与其他植物相关氨基酸一致性较高，主要集中在62％～90％，并且在CHS氨基酸序列中有4个催化活性位点（Cys171、Phe222、His310、Asn343），在CHI氨基酸序列中有4个催化活性位点（Thr50、Tyr108、Asn115、Ser192），在VwF3H氨基酸序列中有5个催化活性位点（Asp218、His253、Arg215、Arg284、Ser286）；VwCHS、VwCHI、VwF3H的蛋白质分子量分别为9．91，5．37，4．1ku，等电点为5．02，5．16，5．44；二级结构预测发现，vwCHs和VwCHI二级结构主要是0t螺旋，分别占43．39％和41．89％，VwF3H的蛋白质二级结构主要是无规则卷曲，占42．30％；聚类分析发现VwCHS、VwCHI和VwF3H分别归属于各自的聚类簇。【结论1VwCHS、VwCHI和VwF3H是不存在信号肽的非跨膜蛋白。

芸薹属查尔酮异构酶基因家族RNA干扰载体的构建

作为类黄酮途径的第二步关键酶,查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)催化四羟基查尔酮成为柚皮素,用于合成各种类黄酮物质,影响多种性状。芸薹属含有多种重要的油料、蔬菜和观赏植物。本研究从甘蓝型油菜克隆了芸薹属CHI基因家族的干扰片段BCHII(761bp),采用NcoⅠ+AatⅡ和BamHⅠ+XbaⅠ双酶切方案分别将其反义片段和正义片段亚克隆到植物RNA干扰(RNAi)平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间,形成了11674bp的RNAi载体pFGC5941M-BCHII(简称pBCHII),多种PCR检测表明2个片段的插入方向正确,重组载体完整,将其转化根癌农杆菌菌株LBA4404以后获得了工程菌株LBA4404-pBCHII-①。本研究结果将促进研究CHI与芸薹属异花授粉、植株色彩、黄籽和抗逆性等性状的关系和开展相关分子育种。

植物查耳酮异构酶生物信息学分析

查耳酮异构酶(CHI)是黄酮类化合物合成途径中的关键酶之一。利用生物信息学方法对该酶基因及编码蛋白进行系统的分析,将为深入开展研究打下基础。本文利用NCBI数据库中注册的CHI基因的核酸及氨基酸序列,以葡萄CHI为主,对其组成成分、疏水性/亲水性、翻译后修饰、蛋白质二级及三级结构等进行预测和推断。结果表明:葡萄CHI不具有明显的亲水或疏水区域;二级结构主要由α-螺旋、不规则卷曲和β-折叠组成,β-转角散布于整个肽链中;β3a-β3f连同α1-α7构成了蛋白三级结构的核心;包含CHI结构域;在高级结构、活性位点等方面具有较高的保守性。

油橄榄查尔酮合酶与查尔酮异构酶基因全长的克隆及序列分析

查尔酮合酶(chalcone synthase,Chs)与查尔酮异构酶(chalcone isomerase,Chi)是植物类黄酮合成代谢途径中的两个关键酶。采用同源克隆、反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、融合引物嵌套PCR(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)与3’-c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA end,RACE)相结合,分别克隆出油橄榄chs与chi基因全长。序列分析表明,油橄榄chs基因全长DNA(Gen Bank登录号:KF935223.1)和c DNA(Gen Bank登录号:KF935224.1)序列分别为2 085 bp和1 173 bp,该基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)编码390个氨基酸,其氨基酸序列与葡萄和番茄全长Chs氨基酸序列的相似度在90%左右。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白属于Chs蛋白家族。油橄榄chi基因全长DNA(Gen Bank登录号:KF886190)和c DNA(Gen Bank登录号:KF886191)序列分别为1 373 bp和750 bp,其ORF编码249个氨基酸,该氨基酸序列与已报道的其他植物Chi氨基酸序列的相似度最高在65%左右,序列中包含一段由198个氨基酸残基组成的具有分子内裂解酶活性的功能域,符合Chi蛋白家族特征。

三叶青查尔酮异构酶基因的克隆及序列分析

目的 阐明三叶青中查尔酮异构酶(CFI)的结构基因信息及其在黄酮生物合成途径中表达调控机制。方法取三叶青新鲜叶片提取总RNA,以所提的总RNA为模板,随机引物(N8)作为引物进行逆转录反应;以逆转录产物为模板,使用正向引物CFI-F与反向引物CFI-R进行PCR;PCR产物经回收纯化后与克隆载体pMD18-T连接并转化至大肠杆菌DH5a,筛选阳性克隆进行测序。结果 测序结果分析显示,该基因片段长为760 bp,含一个长为714 bp的开放阅读框,编码237个氨基酸(NCBI登录号:OP358477)。NCBI数据库BLAST搜索分析显示,该基因编码产物与CFI高度同源;进化树分析表明三叶青的CFI基因与大齿牛果藤的亲缘关系最近。结论 本研究为进一步探究三叶青黄酮类成分的生物合成机制奠定基础。

烟草查尔酮异构酶基因2(NtCHI2)功能分析

烟草查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是黄酮类代谢的一个关键酶,烟草中有两个基因拷贝(NtCHI1、NtCHI2),相关研究多集中在NtCHI1基因,对NtCHI2的研究较少。为研究烟草NtCHI2的功能,主要以NtCHI2的过表达和干扰植株叶片为材料,进行了实时定量PCR和CHI活性分析以及芸香苷含量检测,同时进行了NtCHI2体外表达蛋白的酶活分析。结果表明:NtCHI2体外表达蛋白具有查尔酮异构酶活性;过表达株系中NtCHI2的表达量升高5~75倍,但CHI酶活性和芸香苷含量基本没有变化;干扰株系中NtCHI2的表达量降至70%,CHI酶活性和芸香苷含量分别降低50%和90%。烟草NtCHI2参与芸香苷的合成代谢调控,在一定程度上NtCHI2基因的表达量和芸香苷的含量正相关。

盐肤木查尔酮异构酶的克隆、表达及特性分析

黄酮类化合物是药用植物盐肤木Rhus chinensis中主要的功能成分,具有多种药理活性,广泛用于疾病治疗和食品保健等领域。查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI,EC 5. 5. 1. 6)是黄酮类化合物生物合成途径的关键酶。该研究通过RTPCR及rapid-amplification of c DNA Ends (RACE)技术克隆了盐肤木查尔酮异构酶(命名为Rc CHI)全长c DNA序列共1 058bp,包含738 bp的开放阅读框,编码245个氨基酸。序列分析表明,Rc CHI与其他植物CHI序列相似性在47. 1%~71. 6%,属于Ⅰ型CHI。通过实时荧光定量PCR检测发现盐肤木不同组织总黄酮含量与Rc CHI的mRNA表达呈正相关。进一步构建原核表达载体p GEX-6P-1-RcCHI并转化大肠杆菌BL21,成功获得了重组Rc CHI的高效可溶表达。该研究为利用基因工程菌株进行黄酮类化合物的生物合成奠定了基础。

‘红叶’杜仲叶色转变过程中叶片生理指标变化

【目的】研究‘红叶’杜仲不同时期叶片生理指标变化规律,为揭示其特殊叶色转变机理提供理论依据。【方法】以‘红叶’杜仲和‘小叶’杜仲为材料,选择5个时期进行叶片色素含量测定。分别测定叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮和花色苷含量。使用CR2500型色差计(日本MINOLTA公司)测定L(明度值)、a*(变红度值)及b*(变黄度值),利用a*和b*计算出色泽饱和度(Chroma,C*)和色调角(hur angle,h),并进一步计算叶片颜色指数(color index)。对叶色转变过程及花色苷合成代谢途径中的关键酶苯丙氨酸裂解氨酶(PAL)和查尔酮异构酶(CHI)进行提取和酶活性测定,研究各时期差异显著性并通过相关分析研究各指标间的关联程度。【结果】①‘小叶’杜仲虽与‘红叶’杜仲变化规律相似,但两品种各指标的初始值及变化幅度均存在显著差异。‘小叶’杜仲颜色指数始终属于黄绿级,而‘红叶’杜仲第1、2阶段属于黄绿级,第3、4阶段属于粉红级,第5阶段达到深红级。②两个品种各种色素含量均为逐步上升,但在Ca(叶绿素a含量)、Cb(叶绿素b含量)、CT(总叶绿素含量)、CCar(类胡萝卜素含量)、Cf(类黄酮含量)和CA(花色苷含量)这几种物质含量变化中,叶片颜色变红过程中最关键的是花色苷含量。分别比较两品种第5时期(38 d)相对于第1时期(6 d)各色素含量的增幅,得到‘红叶’杜仲的CA增幅是‘小叶’杜仲的553.96%。③无论‘小叶’杜仲还是‘红叶’杜仲,不同时期的PAL酶活性无显著差异,且各时期两品种的酶活性值大小相近。而‘红叶’杜仲CHI酶活性随着叶色的转变直线上升,第5时期(38 d)为第1时期(6 d)的306.14%,不同阶段间差异达到极显著水平;‘小叶’杜仲CHI酶活性随着叶色转变也有逐步升高的趋势,但是增幅较小,不同时期的酶活性无显著差异。④L、a*及b*与类胡萝卜素含量、花色苷含量及类黄酮含量呈极显著相关,而与叶绿素a含量、叶绿素b含量、总叶绿素含量及叶绿素a与叶绿素b含量比无显著相关关系。CHI酶活性和杜仲叶片L、a*、b*、类胡萝卜素含量、花色苷含量及类黄酮含量间均存在显著或者极显著的相关关系,而PAL与叶片色差值间则无显著相关性。【结论】在‘红叶’杜仲叶片颜色转变过程中,花色苷含量变化幅度远大于叶绿素含量变化幅度,是其呈色的直接原因;‘红叶’杜仲CHI酶活性高在‘红叶’杜仲典型叶色转变过程中具有关键作用。