鸡MHCⅠα和β2m链基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

为进一步研究主要组织相容性复合体Ⅰ类(major histocompatibility complex,MHCⅠ)分子在免疫应答中的作用机制,试验经PCR克隆获得MHCⅠα和β_2m链基因,随后插入带有荧光标签蛋白的真核表达载体,成功构建了重组质粒pEGFP-MHCⅠα和pmCherry-MHCⅠβ_2m,并通过脂质体法转染293T真核表达细胞。荧光显微镜观察可见,MHCⅠα和β_2m分子主要分布于真核细胞的内膜系统,改变了与之融合的荧光蛋白在细胞内的定位。此外,Western blotting检测可见大小约68.3和41.3ku的目的蛋白反应带,表明重组质粒能够在293T细胞中顺利表达,且表达蛋白与鸡MHCⅠ类分子的相应抗体可发生特异性结合反应,具有良好的免疫学活性。

鸡主要组织相容性复合体Ⅰβ微球蛋白(β2m)基因的克隆及序列分析

为深入了解鸡主要组织相容性复合体Ⅰ（major histocompatibility complex classⅠ,MHCⅠ）β微球蛋白（β2m）分子的特征,研究β2m的免疫作用机理,试验通过RT-PCR技术获得了15条3个地方品种鸡完整的典型的MHCⅠβ2 m基因,将该序列与GenBank数据库中登录的鸭、人、鼠、鱼、猴、马和猪7个不同物种的MHCⅠβ2m分子序列进行了比对分析。结果显示,15条鸡β2m氨基酸序列同源性在98.0%~100%之间,大部分序列完全一致。鸡β2m氨基酸序列与鸭同源性最高,为60.6%;最低的则是来源于草鱼的β2m氨基酸序列,仅为33.3%。遗传进化分析进一步证实鸡与鸭的MHCⅠβ2m亲缘关系较近,与其他物种则遗传距离较远。此外,序列分析发现鸡β2 m基因高度保守,仅个别碱基发生突变。其成熟肽序列的第24和79位为半胱氨酸,在所比对的动物中均未发生突变;同时在成熟肽的第77~83位之间存在免疫球蛋白超基因家族的特征基序＂YXCXVXH＂。研究结果表明,鸡与其他物种的MHCⅠβ2m分子具有相同的免疫功能基本单位,同时又具备独特的结构特点。

鸡MHCⅠ类分子克隆及其二聚体融合基因的构建与表达

为进一步研究MHCⅠ类分子作用机制,以及为制备MHCⅠ基因工程疫苗奠定基础,克隆鸡MHCⅠ基因,并构建MHCⅠβ2m-α融合基因进行原核表达。运用RT-PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m链基因,并通过编码连接肽(Gly4Ser)4的基因序列将两者头尾相连,构建了pET-32a-MHCⅠβ2m-α重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组质粒在E.coliBL21细胞进行IPTG诱导表达融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting方法分别检测表达产物。结果表明,成功克隆了MHCⅠα和β2m链基因,长度分别为1014和300 bp;构建的融合基因MHCⅠβ2m-α长度为1194 bp,经原核表达,融合蛋白分子质量约为62.0 ku,能与相应的抗体结合,具有一定的免疫学活性。

三个品系蛋鸭β2m基因的克隆及多态性研究

为明确鸭主要组织相容性复合体Ⅰ(major histocompatibility complex,MHCⅠ)β微球蛋白(β2-microglobulin,β2m)分子的多态性和特征,推进相关免疫研究,本试验对我国3个地方品系蛋鸭的多条β2m基因进行克隆,序列经特征分析、同源比对和遗传进化分析后,进行了高变异位点的计算,并将重要变异位点在3D结构上进行了定位。结果表明,鸭β2m基因高度保守,仅个别碱基发生突变,序列中半胱氨酸、免疫球蛋白超基因家族的特征基序"Yx Cx Vx H"和与重链相互作用的位点均保守性存在;筛选的47条β2m氨基酸序列同源性为95%~100%,完全一致序列普遍存在;鸭β2m氨基酸序列与鸡同源性最高,与鱼类和两栖类最低,结果与遗传进化分析相一致;成熟肽中高变异位点和与重链相互作用的变异位点多位于β折叠上,但不会对β2m的功能产生影响。综合来看,鸭β2m基因保守性高,仅存在一种类型,与MHCⅠ重链的作用方式也相对固定。本试验结果有助于深入理解鸭β2m的分子特性,推动MHCⅠ相关免疫研究的开展。

肺癌患者自然杀伤细胞活性受体NKG2D与可溶性MICA的表达及其相关性分析

目的探讨肺癌患者自然杀伤细胞活性受体（NKG2D）与可溶性MICA（sMICA）的表达及其二者的相关性。方法选取30例肺癌患者作为试验组，30例健康志愿者作为对照组，采用流式细胞术（FCM）与酶联免疫吸附（ELISA）法分别测定两组NKG2D与sMICA分子的表达。结果肺癌患者和健康人群NKG2D分子表达分别为（81．56±8．78）％、（85．63±6．62）％，二者差异有统计学意义（P〈0．05）。肺癌患者和健康对照血清中sMICA分子表达分别为（354．13±80．575）pg／ml、（216．53±48．175）pg／ml，二者差异有统计学意义（P〈0．01）。NKG2D和血清中sMICA分子两个变量之间具有明显相关性（r=-0．349，P=0．006），呈负相关关系。结论NKG2D的表达和血清中sMICA的水平可能成为预测肺癌患者免疫功能状态及肿瘤恶性转移的指标之一。sMICA表达及对NKG2D的负调节机制可能是导致肿瘤细胞发生免疫逃逸的原因之一。该机制可能会为肿瘤生物免疫治疗提供患者适应证指标。

sOVA-linker-β2m融合蛋白构建表位特异的靶结构

目的 构建融合基因sOVA linker β2m ,探讨通过内源性途径递呈的肽在细胞表面形成MHCⅠ类分子复合物的情况。方法 构建了真核表达载体pcDNA3/sOVA linker β2m及不含有 β2m基因的对照载体 ,以研究 β2m是否能在此过程中起到辅助的作用。结果 RT PCR与原位杂交结果显示在各转导细胞中均有融合基因的正确表达 ,且二者的表达水平差异无显著性 (P >0 .0 5 )。进一步对细胞内、细胞表面H 2Kb OVA复合物的分布进行分析 ,表明各转导细胞中均有正确的蛋白质分子翻译合成 ,并能表达在细胞表面 ,但融合有 β2m基因的EL4 /eb2m细胞的表达量远远高于没有融合 β2m基因的转导细胞EL4 /OVA。结论 β2m基因与特异性抗原肽的融合 ,易于形成稳定的MHCⅠ类分子复合物 ,提高抗原呈递效率。

食管癌患者自然杀伤细胞活化性受体NKG2D及其分泌性配体sMICA的检测

目的探讨宿主自然杀伤（NK）细胞受体NKG2D在抗食管癌中的作用及其与肿瘤免疫逃逸的关系。方法用流式细胞术检测50例食管癌、26名健康对照外周血NK细胞NKG2D的表达状况，用酶联免疫吸附（ELISA）法检测外周血中可溶性MHC-1类链相关分子A（sMICA）的含量表达。结果食管癌患者手术前后及健康对照外周血NK细胞NKG2D的表达水平分别为（87．25±3．06）％、（88．38±4．24）％、（92．46±1．46）％，两组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。相应配体sMICA在食管癌患者血清中的表达较健康人中增高，但差异无统计学意义（P〉0．05）；在食管癌患者中不同肿瘤大小、分化程度、手术分期及是否有淋巴结转移等中表达差异无统计学意义（P〉0．05）；但在晚期患者（Ⅲ、Ⅳ期）和有淋巴结转移者中较健康对照明显增高，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论食管癌患者外周血NK细胞活性降低，其活化性受体NKG2D表达的下降是NK细胞活性下降的原因之一。食管癌患者免疫逃逸可能与NKG2D表达下调及其配体sMICA的表达升高有关。