应用PCR从AA肉种鸡鸡胚和1日龄雏鸡体内检测出CIAV和ALV-J

为了了解鸡传染性贫血病病毒(CIAV)和J亚群禽白血病病毒(ALV-J)对AA肉种鸡鸡胚和1日龄雏鸡的感染情况,试验直接从山东省3个不同AA肉种鸡场的鸡胚和1日龄雏鸡的肝、脾、肾、胸腺、骨髓、法氏囊等组织(器官)提取DNA,进行了PCR扩增及PCR产物的克隆和序列测定。结果显示,被检的3个肉种鸡场的鸡胚和1日龄雏鸡体内均有这2种病毒核酸的检出,其中CIAV的阳性率是20.42%,ALV-J的阳性率是15.83%,二者共感染的阳性率是6.25%;在阳性检出率中弱雏>死胚>健康雏>正常胚。病毒核酸在各感染组织(器官)的含量也有所差异,CIAV以脾的含量最多,ALV-J以肾的含量最多。对肝进行细菌分离鉴定时发现,3个鸡场还存在大肠杆菌、沙门氏菌和霉形体的混合感染。结果提示,在AA肉种鸡鸡胚和雏鸡体内存在CIAV、ALV-J的感染和二者的共感染以及继发性大肠杆菌、沙门氏菌和霉形体的混合感染。

元宝鸡中ALV-J与CIAV混合感染的鉴定及其分子进化分析

为了诊断巢湖地区送检元宝鸡的病情,试验进行了剖检观察、制备病理组织切片、设计特异性引物用PCR扩增几种常见免疫抑制病毒序列,并将测序结果用DNAStar软件与已报道的序列进行比对分析。结果表明:测序所得结果与NCBI上报道的J亚群禽白血病病毒(ALV-J)和鸡传染性贫血病毒(CIAV)序列结果一致,并且ALV-J序列同源性在93.4%~98.2%之间,CIAV序列同源性在97.5%~99.2%之间。说明巢湖地区送检的元宝鸡感染了ALV-J和CIAV,并且元宝鸡感染的ALV-J基因序列与英国株Z46390.1同源性最高,为98.2%,而检测到的CIAV与国内外已报道的鸡传染性贫血病毒同源性最高,为99.2%。

鸡传染性贫血病毒与其他禽免疫抑制性疾病病毒的混合感染

应用多重PCR方法对广西主要养鸡地区的514只可疑鸡传染性贫血与其他禽免疫抑制性疾病临床病/死鸡进行了检测。结果显示,鸡传染性贫血病毒(CIAV)与其他禽免疫抑制性疾病病毒的二重或多重感染率达48.05%;CIAV阳性鸡群中,马立克氏病病毒(MDV)、网状内皮增生症病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)的群阳性率和个体阳性率均明显高于CIAV阴性鸡群,表明CIAV的感染与3种肿瘤病病毒的感染具有明显相关性,其中CIAV与MDV的感染具有明显相互促进作用;被调查鸡群中,传染性法氏囊病病毒(IBDV)和禽呼肠孤病毒(ARV)也有一定的感染率。结果表明,商业鸡群中各种免疫抑制性病毒的混合感染很普遍,与鸡群临床上所表现的生长阻滞、疫苗免疫效果不佳、总的发病率和死淘率增加等密切相关。

我国部分地区蛋鸡群ALV-J及与REV、MDV、CAV混合感染检测

为了解J亚群禽白血病病毒(ALV-J)及其与禽网状内皮细胞增生症病毒(REV)、马立克氏病病毒(MDV)和鸡传染性贫血病病毒(CAV)的混合感染现象,本研究从宁夏、湖北、广东、山东、辽宁、吉林、黑龙江7个省的39个蛋鸡群收集临床表现和剖检病理变化疑似禽白血病的病料样品184份,采用PCR、病毒分离和IFA检测样品中ALV-J、REV、MDV和CAV。结果表明,7个省蛋鸡场均存在ALV-J感染,病料样品阳性率为60.9%,检测鸡群阳性率为82.1%,与REV、MDV、CAV的混合感染率分别为13.6%、24.5%、22.8%,其中存在较为严重的双重感染(29.0%)和3重感染(18.8%),甚至4重感染(1.7%)。研究结果表明,我国蛋鸡群中普遍存在ALV-J感染,而且与REV、MDV、CAV混合感染严重;提示ALV-J已经可以引起蛋鸡群发病,在临床诊断和致病性研究中,应考虑到多重感染的影响。

传染性法氏囊病病料中MDV、CAV、REV的共感染检测

从江苏、山东、浙江、河南、上海、广西、云南等地收集根据临床表现及病理变化诊断为传染性法氏囊病( IBD)的病鸡法氏囊样品 66份 ,用相应的核酸探针及斑点杂交法分别检测样品中鸡传染性贫血病病毒( CAV)、马立克氏病病毒 ( MDV)、网状内皮细胞增生病病毒 ( REV)的感染 ;用抗 IBD血清做琼扩检测 IB-DV。结果显示 ,部分地区病料中这些病毒有不同程度的二重感染、三重感染甚至四重感染。提示在研究特定毒株 IBDV的毒力时 ,应考虑多重感染对致病性的影响。

CAV与REV共感染SPF鸡对疫苗免疫反应的抑制作用

用1日龄SPF鸡人工感染鸡贫血病毒(CAV)和禽网状内皮增生病病毒(REV),探讨病毒感染对鸡体疫苗免疫反应的影响。结果表明,在用禽流感病毒(AIV,H5和H9)疫苗免疫后,CAV与REV单独感染均显著抑制了鸡体对H5和H9亚型禽流感病毒灭活疫苗的HI抗体反应,在CAV与REV共感染后,这种抑制作用更为明显。CAV单独感染后鸡体对新城疫病毒(NDV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)疫苗的免疫反应受到抑制,但与对照组在统计学上的差异不显著,然而,CAV可以显著加重REV感染对鸡体在NDV和IBDV疫苗免疫后抗体反应的抑制作用。从而证实CAV与REV共感染在疫苗免疫抑制上有协同作用。

鸡传染性贫血病毒VP2基因的表达及其免疫活性分析

利用特异性引物从组织病料中提取的鸡传染性贫血病毒核酸经PCR扩增得到VP2基因,BamHⅠ和SalⅠ双酶切处理,纯化后,克隆至BamHⅠ和SalⅠ双酶切处理的表达载体pET-28a中,构建了原核表达质粒pET-28-VP2。将pET-28-VP2转化至感受态E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约31kDa的目的蛋白以可溶性形式表达于上清中。Western blot分析发现,表达产物与鸡传染性贫血的阳性血清发生特异性反应。纯化蛋白免疫小鼠后制得的多抗可以与全病毒发生反应,证明其具有免疫原性,为进一步研究VP2蛋白的功能及开展CIAV疫苗及诊断试剂的研制奠定了基础。

鸡传染性贫血病毒与马立克氏病病毒共感染SPF鸡群免疫抑制协同作用的研究

将鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV or CAV)和马立克氏病病毒(Marek s dis-ease virus,MDV)人工单一和共同感染1日龄的SPF鸡,感染后分别于14、21、28、35日龄检测鸡体红细胞压积的变化,并检测鸡群疫苗免疫3周后的抗体反应,以探讨CAV与MDV共感染对鸡体的免疫抑制是否有协同作用。结果表明,在血液分析方面,CAV与MDV共感染组较病毒单一感染组与对照组差异极显著,共感染不仅加重了鸡群贫血现象,而且延长了贫血的病理症状;而在禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)H5/H9疫苗、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)疫苗和传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)疫苗免疫后3周的抗体检测中,CAV与MDV共感染组较其它各实验组差异极显著,抗体滴度大大低于其它实验组;此外,CAV与MDV共感染组,鸡体生长状况明显差于实验各组,有6只鸡只死亡(6/25),比病毒单一感染时的死亡率大大增加。综上研究证明,CAV与MDV共感染在免疫抑制作用上有协同作用。

我国自然发病鸡群中MDV、REV和CAV共感染的检测

从山东、河南、河北、北京、江苏、广东、广西、四川、吉林、辽宁、台湾11 省42 个不同鸡群收集临床有发病表现的828只病、死鸡的病理组织样品,用点杂交方法检测各个样品中马立克氏病病(Marek′s disease virus,MDV)、网状内皮细胞增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV) 、鸡传染性贫血病病毒(Chicken anemia virus,CAV)的感染情况。结果表明:828 只病鸡中这三种病毒的检出率均相当高,分别为83. 94% (MDV)、61. 0% (CAV)和57.25%(REV),并且存在非常严重的双重感染(31. 16%)和三重感染(44. 69%),单重感染和阴性个体仅占15.34%和8.82%;在42个鸡群中的29个存在三重感染,占鸡群总数的69.05%,5个鸡群存在MDV和CAV的共感染,3个鸡群存在MDV和REV的共感染,二重感染占鸡群总数的19.05%,仅有2个鸡群未检测到这三种病毒;在地域分布上,11个省份均检测到了MDV、CAV和REV,表明了这三种病毒在我国的广泛分布及其在生产鸡群中的混合感染是导致当前我国养禽业生产性能下降、条件致病性疾病发生严重、临床腺胃肿大症状发生的重要原因。

免疫抑制鸡群鸡传染性贫血病毒和网状内皮增生症病毒共感染检测

分别用 digoxigenin标记的鸡传染性贫血病毒 (CAV)和禽网状内皮增生症病毒 (REV)核酸探针以及 PCR技术对某种鸡场进行检测。检测结果表明 ,在 2 0个样品中 ,CAV和 REV感染的阳性率分别为 1 0 %和 5%。这一结果显示 ,CAV和 REV感染是导致该鸡场发生免疫抑制的主要病因之一。

鸡传染性贫血病病毒与三种致家禽肿瘤病毒混合感染的流行病学研究

根据鸡传染性贫血病病毒(CIAV)、马立克氏病病毒(MDV)、网状内皮组织增生症病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)基因保守序列各设计1对特异性引物,采集102份发病家禽的肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊等病料,通过RT-PCR和PCR方法进行检测。结果显示:CIAV、MDV、REV、ALV单一感染检出率分别为23.5%(24/102)、4.9%(5/102)、1.0%(1/102)、8.8%(9/102);CIAV和MDV、CIAV和REV、CIAV和ALV、MDV和REV、MDV和ALV、REV和ALV二重感染率分别为2.0%(2/102)、4.9%(5/102)、10.8%(11/102)、2.0%(2/102)、2.0%(2/102)、1.0%(1/102);三重感染中CIAV、MDV和REV为0(0/102),CIAV、MDV和ALV为3.9%(4/102),CIAV、REV和ALV为7.9%(8/102),MDV、REV和ALV为1.0%(1/102);四重感染率为1.0%(1/102)。26份样品中四种病毒均未检出。CIAV阳性病料与阴性病料相对应的REV共感染率具有极显著差异(P<0.01),CIAV阳性病料与阴性病料相对应的ALV共感染率具有显著差异(0.01<P<0.05)。研究结果进一步丰富了四种病毒的流行病学数据。

用PCR检测肉种鸡的鸡胚、雏鸡和子代肉鸡CAV和ALV

为了解CAV和ALV在不同阶段对肉鸡的感染情况,应用PCR方法,对山东省某3个中小型AA肉种鸡场的鸡胚、1日龄雏鸡和子代肉鸡中的CAV和ALV进行检测,试验直接采集样品的不同组织提取DNA,进行PCR扩增及PCR产物的克隆和序列测定。结果显示,被检的3个肉种鸡场及商品肉仔鸡均有这两种病毒的感染,其中CAV的阳性率24.22%;ALV的阳性率17.56%,两者共感染的阳性率8.89%。而且感染鸡各组织病毒含量也有差异,CAV以脾脏最多,ALV以肾脏最多。同时对肝脏进行细菌分离培养,并对40日龄子代商品肉鸡进行ND血凝抑制(HI)抗体效价检测,发现大肠杆菌等细菌感染阳性率较高,ND-HI抗体效价显著偏低。由此可见,鸡胚、雏鸡和子代肉鸡体内存在CAV、ALV的感染以及与细菌性疾病的共感染,造成机体免疫力下降。

鸡传染性贫血病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备

以原核表达的鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP3蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,融合阳性细胞用间接ELISA方法检测,阳性细胞株经3代克隆纯化后,获得3株能稳定分泌抗CIAVVP3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为AG2、BC11、FG1。3株杂交瘤细胞株产生的细胞培养液上清和小鼠腹水的ELISA效价分别为2.5×102、1.5×102、1×102和2×106、1×106、2.5×105。与其它禽类病毒的交叉实验表明:这3株单抗具有良好的抗CIAVVP3蛋白特异性。该特异性单克隆抗体的研制成功为进一步研究VP3的生物学特性打下了基础。

应用PCR对来源于AA肉种鸡的鸡胚、雏鸡进行CAV和ALV检测

应用PCR方法,对来源于山东省3个不同AA肉种鸡场的鸡胚、1日龄雏鸡中的CAV和ALV进行检测,从而了解CAV和ALV在此阶段对肉鸡的感染情况。试验直接采集样品的肝脏、胸腺、骨髓、脾脏、肾脏、法氏囊等组织提取DNA,进行PCR扩增及PCR产物的克隆和序列测定。结果显示,被检的3个肉种鸡场均有这两种病毒的阳性检出,其中CAV的阳性率是20.18%;ALV的阳性率13.49%,二者共感染的阳性率是6.24%。而且感染鸡各组织含量也有所差异,其中CAV以脾脏的最多,ALV以肾脏最多。同时对肝脏进行细菌分离培养时发现存在大肠杆菌、沙门氏菌和霉形体的混合感染。由此可见,在鸡胚和雏鸡体内存在CAV、ALV的感染以及与细菌性疾病的共感染。

鸡贫血病毒全长基因感染性分子克隆的构建

PCR法扩增鸡贫血病毒全长基因组,将2个全长基因组顺向连接插入到pBluescriptΠSK(+)质粒载体中,获得Psk2CAV质粒并转染MDCC-MSB1细胞,盲传4代后,用间接免疫荧光抗体试验(IFA)能检测到特异性荧光。将Psk2CAV质粒DNA于腿部肌肉接种10羽1日龄CAV阴性SPF鸡。剖检结果显示,阳性对照组和Psk2CAV质粒组均有鸡只出现腿肌、胸肌轻微出血,胸腺出现萎缩或出血。组织病理学结果显示,阳性对照组和Psk2CAV质粒组胸腺小叶萎缩,出血、淤血,髓质部萎缩,淋巴细胞减少。通过PCR可以分别从体外感染MDCC-MSB1细胞和体内感染鸡只中扩增到病毒基因片段。本研究证明含有双拷贝CAV的重组质粒Psk2CAV在体内、外均具有感染性,能衍生出病毒,并产生符合自然感染CAV的大体病变和组织病理学变化。

肉鸡及其鸡胚中CAV和ALV的PCR检测

应用PCR技术对山东省3个中小型AA肉种鸡场的鸡胚、1日龄雏鸡和子代肉鸡CAV和ALV的感染情况进行了检测。用相同的方法直接采集样品的不同组织提取2种病毒DNA,进行PCR扩增及PCR产物的克隆和序列测定。结果表明:被检的3个肉种鸡场均有这2种病毒的感染,其中CAV的阳性率24.22%,ALV的阳性率17.56%,二者共感染的阳性率8.89%。感染鸡各组织中病毒含量也有差异,CAV以脾脏最多,ALV以肾脏最多。对肝脏进行细菌分离培养,并对40日龄商品肉鸡进行ND血凝抑制(HI)抗体效价检测,发现大肠杆菌等细菌感染阳性率较高,ND-HI抗体效价显著偏低。说明该地区肉种鸡场和商品鸡场均存在严重的CAV和ALV感染以及与细菌性疾病的共感染,并导致鸡只的机体免疫力下降。

不同日龄肉鸡感染网状内皮增生症和传染性贫血动态分布及抗体产生规律

为了解禽网状内皮增生症(REV)和传染性贫血(CAV)在商品肉鸡中的感染情况,对某鸡场不同日龄商品肉鸡,通过斑点杂交和ELISA,对这两种免疫抑制病进行抗原和抗体检测。结果表明:137份病料中REV感染率为2.19%,高于CAV的感染率(1.46%),相对应的90份血清样品中REV抗体水平都低于相同日龄CAV抗体水平(42日龄除外),且都低于50%。这些检测结果为该商品肉鸡制定合理的免疫程序提供可靠生物学背景,具有重要的兽医临床指导意义。

鸡传染性贫血病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)的实时荧光定量PCR检测方法,本试验通过CIAV基因组保守区域设计1对扩增片段大小为180bp的特异性引物,构建pGM-T-CIAV重组质粒,制备阳性标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果显示,CIAV的Ct阈值与标准品浓度在5.33×108至5.33×103拷贝/μL间呈良好的线性关系,相关系数R2=0.998,斜率为-3.443,产物Tm值在86℃左右。该方法与网状内皮组织增生病病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)J亚型、马立克氏病病毒(MDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组均无交叉反应,敏感性为5.33拷贝/μL,比普通PCR高1 000倍,批内和批间重复试验变异系数均小于3%。结果表明,本试验建立的CIAV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可实现对鸡传染性贫血病的早期诊断及感染程度的定量分析的检测。

一例鸡细小病毒、鸡传染性贫血病毒及鸡传染性支气管炎病毒共感染病例的检测

【目的】对福建省南平市某肉鸡场不明病因造成肉鸡死亡的病原进行确诊。【方法】通过对鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)、腺病毒(Fowl adenovirus, FadV)、鸡细小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)、新城疫病毒(Newcastlediseasevirus, NDV)、鸡传染性贫血病毒(Chickeninfectiousanemiavirus,CIAV)、传染性法氏囊病毒(InfectiousbursalDiseasevirus, IBDV)、喉气管炎病毒(Laryngotracheitisvirus,LTV)、禽肾炎病毒(Avian nephritis virus,ANV)等病原进行PCR检测,并对扩增片段进行克隆测序,利用生物信息学软件对测序结果进行分析。【结果】PCR检测结果及测序结果显示:鸡细小病毒ChPV、鸡传染性支气管炎病毒IBV、鸡传染性贫血病病毒CIAV为阳性,其余病原检测结果均为阴性。同源性分析结果显示分离株与ChPV的同源性为92.17%~100%,与IBV的同源性为76.9%~84.3%,与CIAV的同源性为91.19%~92.14%;遗传进化树分析结果显示分离到的IBV毒株及CIAV毒株均独处于一个单独的分支,分离到的ChPV毒株与广西参考株亲缘关系较近。【结论】从南平市某鸡场检测到ChPV、IBV、CIAV等3种病原的共感染病例,分离到的IBV毒株的S1基因及CIAV毒株的VP1基因可能已经发生变异。

鸡传染性贫血病毒VP3基因的原核表达及抗血清制备

为了研究鸡传染性贫血病毒(Chicken anemia virus,CIAV)VP3蛋白与病毒自身蛋白之间的相互作用,需对该蛋白进行原核表达制备相应兔源抗血清,试验通过提取CIAV M9905株基因组DNA,PCR扩增出VP3基因,构建重组质粒pET30a(+)-VP3,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,进一步通过IPTG诱导表达后用Ni-NTA亲和柱纯化获得融合蛋白,经SDS-PAGE分析后对融合蛋白进行乳化,免疫新西兰兔制备抗血清,并对其进行ELISA效价测定、Western-blot及IFA检测。结果表明:SDS-PAGE分析证实获得高纯度的重组蛋白VP3,大小约为22 ku,且其在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在;ELISA法检测制备的兔源抗VP3血清效价在1∶6 400以上;经Western-blot及IFA检测证实,VP3兔源血清可特异性结合Vero细胞表达的VP3蛋白。说明试验成功表达出CIAV VP3蛋白,制备的兔抗血清具有较好的特异性。