鸡白细胞介素-6的原核表达及其对疫苗免疫增强效果的研究

本研究采用PCR技术,扩增、克隆了鸡白细胞介素-6(ChIL-6)成熟肽基因并进行原核表达,对表达的鸡白细胞介素-6组蛋白(rChIL-6)通过尿素变性、复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,经测定rChIL-6的促小鼠脾脏淋巴母细胞的增殖能力来评估重组蛋白的生物学活性;用4个不同浓度的rChIL-6在不同部位与NDV活疫苗、AIVH5N1灭活疫苗同时肌肉注射来评价其免疫增强作用。研究结果表明,表达rChIL-6为25ku左右,经纯化后的蛋白纯度在95%以上;100pg/mLrChIL-6注射组具有较高的促小鼠脾淋巴母细胞增殖活性;不同浓度的rChIL-6注射组对NDV和AIVH5N1疫苗都具有较好的免疫增强作用,但对其免疫抗体产生时间及抗体滴度峰值出现和维持时间均没有明显的影响,其中0.03μg/mLrChIL-6浓度注射组的对鸡疫苗的免疫增强作用最明显,过高或过低浓度的rChIL-6对疫苗免疫增强作用不显著。这些研究为新型免疫增强佐剂开发以及鸡免疫失败性疫病的预防和治疗奠定了基础。

鸡白介素-6(ChIL-6)基因的克隆与序列分析

分别用鸡传染性法氏囊病病毒感染和用ConA免疫刺激健康鸡 ,无菌取处理鸡的脾脏 ,匀浆后用Tr izol抽提细胞总RNA ,应用随机引物反转录获得cDNA ,设计引物 ,经PCR扩增获得鸡白介素 - 6 (ChIL - 6 )基因 ,应用pGEM -T载体克隆该基因 ,经测序 ,表明其与GeneBank中公布的唯一的一个ChIL - 6基因为同源基因。

鸡IL-6真核表达载体的构建及其对新城疫LaSota疫苗的免疫增强作用研究

利用RT-PCR方法从ConA诱导的鸡脾淋巴细胞RNA中扩增出IL-6基因,与pCI-neo连接构建真核表达质粒pCI-IL-6,并研究pCI-IL-6在CEF细胞中的表达及其对新城疫LaSota疫苗的免疫增强作用。研究发现,pCI-IL-6在CEF细胞中得到表达,pCI-IL-6和LaSota疫苗联合免疫组HI抗体、CD4+、CD8+和CD3+T淋巴细胞百分含量从免疫后第14天起均高于LaSota疫苗单独免疫组。其中,HI抗体效价在第14、21和35天时差异显著(P<0.05),在第28天时差异极显著(P<0.01);CD4+、CD8+和CD3+T淋巴细胞百分含量在第14天后表现为差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。在免疫后第35天进行攻毒,pCI-IL-6和LaSota疫苗联合免疫组的保护率为89.5%,而LaSota疫苗单独免疫组的保护率为76.5%。结果表明,pCI-IL-6真核表达质粒在鸡体内成功表达,并能明显提高新城疫LaSota疫苗的免疫效果,具有免疫增强作用。

共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒免疫抗体消长规律及免疫效力研究

为评价共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒(rFPV-AIH5AIL6)的免疫抗体消长规律及免疫效力,将重组病毒通过颈部皮下注射和翅部皮下注射2种不同的免疫途径来免疫鸡群,结果发现,2种免疫途径中,重组鸡痘病毒对鸡体质量增加均无影响,而野生型鸡痘病毒均可抑制鸡体质量增加。翅部皮下注射疫苗组能够产生较高的血凝抑制(HI)抗体水平,免疫21d后抗体水平达到高峰,28d后开始下降,49d时仍保持在一定的水平。免疫SPF鸡21d后攻毒,表明该重组病毒能使经滴鼻攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为95%,与油苗组相同,与单表达H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒组(40%)差异显著;攻毒后3、5、7d采集喉头、泄殖腔棉拭子检测排毒情况,结果发现第3天排毒率最高,其中rFPV-AIH5AIL6免疫组排毒率为最低,显示IL-6在rFPV-AIH5IL6免疫过程中起到了免疫佐剂的作用,这为研制新型的禽流感重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础。

鸡白细胞介素-6活性MTT检测方法的建立

采用白细胞介素-6依赖细胞株B9建立了鸡白细胞介素-6活性的MTT检测方法。每孔培养细胞数在2．5×10^3～4×10^4范围内D值与细胞数显示有良好的线性关系，MTT的最佳保留时间为4h，最低检测限为0．1U／mL。应用该方法检测了健康艾维菌肉鸡25例，血清chIL-6活性为（4．33±0.75）U／mL，而25例葡萄球菌病患鸡血清chIL-6的活性为（14．05±6．87）U／mL，与健康肉鸡比较差异极显著（P〈0．01），为该方法进一步临床应用奠定了基础。

IL-6基因启动子区单核苷酸多态对京海黄鸡柔嫩艾美尔球虫抗性指标的影响

为探究白介素6(IL-6)基因5′启动子区单核苷酸突变对鸡柔嫩艾美尔球虫抗性指标的影响,以京海黄鸡为试验材料,对IL-6基因5′调控区单核苷酸多态性(SNPs)进行检测,根据感染组与对照组血浆抗性指标酶联免疫吸附试验检测结果,分析SNPs突变形成的基因型与抗性指标的关联。结果表明:感染组与对照组间过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量差异极显著,超氧化物歧化酶(SOD)活性及IL-2、IL-16、IL-17、γ干扰素(IFN-γ)水平和体增重差异显著;通过京海黄鸡IL-6基因启动子区基因序列与GenBank上的SNPs数据库比对,发现3个新的SNPs(A-663G、C-447G和G-357A),其中A-663G位点只有1种基因型GG,C-447G和G-357A位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态且多态性丰富;C-447G突变位点各基因型间比较发现,血浆CAT、SOD、GSH-Px活性及IL-2、IL-16、IL-17水平和体增重差异极显著,MDA含量差异显著;G-357A突变位点各基因型间比较发现,血浆CAT、SOD活性及IL-16水平和体增重差异极显著,GSH-Px活性和IL-17水平差异显著。就主要抗性指标而言,C-447G和G-357A2个突变位点的CC和AA纯合型个体优于其他基因型个体,CC和AA基因型分别为2个突变位点鸡球虫抗性有利基因型,这一结果为京海黄鸡鸡球虫抗性分子标记辅助育种提供了参考。

共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性研究

为评价共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒(rFPV-AIH5AIL6)的遗传稳定性,本研究将其接种CEF,绘制生长曲线。结果显示,该重组病毒与亲本病毒的生长速度及蚀斑大小一致;在CEF连续培养20代,取第0代、5代、10代、20代重组病毒PCR扩增HA和IL-6基因进行鉴定,显示HA基因无核苷酸突变,IL-6基因在第20代时有1个氨基酸发生突变,但不影响该蛋白的功能区;间接免疫荧光试验证明所选代次病毒均能够表达HA蛋白,RT-PCR试验表明各代次病毒均可以表达鸡IL-6基因;通过蓝斑鉴定重组病毒纯度,结果显示所有蚀斑均为蓝斑。因此,该重组鸡痘病毒具有良好的遗传稳定性,符合兽医生物制品的生产要求。

重组大肠杆菌pQE30-ChIL-6/JM109的遗传稳定性研究

为研究携带鸡白细胞介素-6(ChIL-6)基因的重组大肠杆菌pQE30-ChIL-6/JM109的遗传稳定性。本文通过菌株传代方法将重组菌株pQE30-ChIL-6/JM109在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中连续传至100代,选取第1、10、20、50、100代菌株为研究对象,分别比较各代次菌株的菌落形态、细菌形态、质粒保有率、生长速度等差异;取各代次菌株提取质粒DNA且分别进行双酶切及PCR鉴定、DNA序列比对;诱导表达各代次菌株,比较其重组ChIL-6蛋白的表达水平及免疫反应性。结果表明,各代次菌株菌落形态、生长速度等方面无明显差异;在传至100代时的质粒保有率为89%;各代次菌株重组质粒电泳图谱、酶切图谱、PCR图谱均未改变,未见ChIL-6基因变异;各代次菌株的蛋白电泳图谱、ChIL-6蛋白表达量、ChIL-6蛋白的体外促鸡脾淋巴细胞增殖活性无明显差异。结果提示,重组大肠杆菌pQE30-ChIL-6/JM109具有较好的遗传稳定性。

重组鸡白细胞介素6对不同种类疫苗的免疫增强作用

为评价重组鸡白细胞介素6(rChIL-6)在商品鸡体内对不同种类疫苗的免疫增强作用,采用不同接种方式,应用rChIL-6分别对不同种类新城疫病毒(NDV)单联疫苗和新城疫病毒-传染性支气管炎病毒-禽流感病毒H9亚型三联疫苗(NDV-IBV-H9)进行了免疫增强试验以及传染性法氏囊病病毒(IBDV)单联油乳剂灭活疫苗的免疫增强田间试验,并进行了将rChIL-6与NDV Ⅳ系预混合乳化制备成的灭活疫苗的免疫试验。结果表明,将rChIL-6与NDVⅣ系、Ⅰ系活疫苗预混合后分别采用滴鼻点眼、肌肉注射接种方式的免疫增强效果优于其他方式;rChIL-6与NDV抗原预混后制备成油乳剂灭活疫苗的免疫增强效果优于将相同抗原量的NDV油乳剂灭活疫苗和rChIL-6同时分点免疫接种。rChIL-6对NDV油乳剂灭活疫苗的免疫增强效果优于活疫苗,对NDV单联灭活疫苗的免疫增强效果优于NDV-IBV-H9三联灭活疫苗。田间试验表明,rChIL-6对IBDV油乳剂灭活疫苗首免和二免都具有显著的免疫增强作用,二免的免疫增强效果优于首免。这些研究结果为进一步开展新型鸡基因工程免疫增强剂研究奠定了基础。

鸡白细胞介素-6原核表达及双抗夹心ELISA方法的建立

应用分子生物学技术原核表达ChIL-6,以ChIL-6重组蛋白为免疫原,按免疫程序分别制备兔抗和鼠抗IL-6重组蛋白的多克隆抗体。应用此抗体建立双抗夹心ELISA方法后,为了优化此方法本试验对该方法的最佳试验条件、标准曲线、重复性和初步应用进行确定。结果显示,经SDS-PAGE和Western-blot分析,表明ChIL-6在大肠杆菌中正确表达,为了建立检测ChIL-6的双抗夹心ELISA方法,本试验应用表达的重组蛋白制备兔抗和鼠抗多克隆抗体。建立的双抗夹心ELISA方法最佳反应条件为包被抗体的质量浓度为50mg/L,4℃过夜;酶标二抗稀释度为1∶400,37℃1h;应用该方法检测感染金黄色葡萄球菌后的ChIL-6,其结果与本实验室之前应用人的ELISA试剂盒检测的结果相似。结果表明,本试验建立的检测ChIL-6的双抗夹心ELISA方法可用于临床。

重组鸡白细胞介素-6(rChIL-6)对传染性法氏囊灭活疫苗的免疫增强机理研究

为了评价重组鸡白细胞介素-6（rChIL-6）蛋白在鸡体内的免疫增强作用机理,本研究将40只7日龄健康SPF鸡随机平均分为4组以进行rChIL-6蛋白对鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）灭活疫苗免疫增强作用试验,于14日龄时进行免疫接种和rChIL-6蛋白注射。分别检测4组鸡免疫前和免疫后不同时间血清中IBDV抗体水平、不同细胞因子表达水平、脾淋巴细胞增殖活性和外周血T淋巴细胞增殖活性等指标以揭示rChIL-6蛋白在机体内对疫苗的免疫增强机理。结果表明：免疫后7~49d,rChIL-6蛋白与IBDV灭活疫苗共免疫组（第4组）鸡血清中IBDV抗体水平极显著高于IBDV灭活疫苗对照组（P〈0.01）;免疫后7~35d,第4组鸡血清中的白细胞介素-4、6、2（ChIL-4、ChIL-6、ChIL-2）和γ干扰素（ChIFN-γ）等4种细胞因子的表达水平极显著高于其他3组对照组（P〈0.01）,α干扰素（ChIFN-α）的表达水平于免疫后14~35d期间极显著高于其他3组对照鸡（P〈0.01）;rChIL-6蛋白单独应用后可显著提高机体的ChIL-4、ChIL-6和ChIL-2的表达水平,但对ChIFN-γ、ChIFN-α的表达水平无明显影响。免疫后7~14d,第4组鸡的脾淋巴细胞增殖活性显著高于其他3组对照鸡（P〈0.01）;免疫后7~21d,第4组鸡的外周血T淋巴细胞的增殖活性稍高于其他3组对照组（P〉0.05）。结果表明,rChIL-6在体液免疫和细胞免疫水平对鸡传染性法氏囊灭活疫苗免疫后均具有免疫增强作用;对机体体液免疫应答的增强能力高于细胞免疫应答。

重组鸡白细胞介素-6-2融合蛋白对鸡T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫活性的影响

为研究重组鸡白细胞介素-6-2融合蛋白（rChIL-6-Linker-ChIL-2）对鸡体免疫功能的影响,采用MTS法检测重组融合蛋白在28日龄SPF鸡体内接种后不同时间对外周血淋巴细胞（PBLC）中T淋巴细胞和脾B淋巴细胞增殖活性的影响,采用流式细胞术检测它对鸡PBLC中CD3＋CD4＋T淋巴细胞、CD3＋CD8＋T淋巴细胞百分含量及CD4＋/CD8＋比值的影响。结果显示,接种后第7~35天,重组融合蛋白可显著提高鸡体PBLC中T淋巴细胞和脾中B淋巴细胞的增殖活性,两者活性分别高于单一rChIL-2蛋白或单一rChIL-6蛋白对照、低于或接近于rChIL-6蛋白＋rChIL-2蛋白混合物。接种后第7~21天,重组融合蛋白可显著提高CD3＋CD4＋T淋巴细胞百分含量、降低CD3＋CD8＋T淋巴细胞百分含量,显著提高CD4＋/CD8＋比值,其活性显著高于单一rChIL-6蛋白或单一rChIL-2蛋白对照,但与rChIL-6蛋白＋rChIL-2蛋白混合组差异不显著。结果表明,重组融合蛋白在鸡体内可显著促进T、B淋巴细胞增殖,提高CD3＋CD4＋T淋巴细胞百分含量和CD4＋/CD8＋比值,从而增强鸡体的体液免疫和细胞免疫功能;重组融合蛋白在体内发挥了ChIL-6和ChIL-2的协同作用活性。