一种高效小鼠骨髓红系造血岛富集方法的建立

红系造血岛(erythroblastic island,EBI)是哺乳动物红细胞终末分化的独特微环境,EBI研究对于深入理解生理和病理条件下造血微环境的组成和变化至关重要。骨髓中EBI分布较为分散,现有富集方法的富集效果不尽如人意。研究旨在建立一种新的更高效的小鼠骨髓EBI富集方法。在前人研究的基础上进行了创新和优化,建立了以二次密度梯度沉降结合洗涤去除非EBI细胞团为核心的富集方法。通过细胞团形态观察、瑞氏吉姆萨染色、成像流式技术(imaging flow cytometry,IFC)等手段比较了该方法与现有富集方法的富集效果,在直接镜检和瑞氏吉姆萨染色中发现,方法4富集体系中少见单细胞,主要为以巨噬细胞为核心周围围绕红细胞的典型EBI结构。使用IFC技术对于F4/80、CD71以及CD11b进行分析,富集产物中约63.7%的细胞团为EBI,高出之前方法的最高标准(方法3),约38.4%。富集的EBI中发现巨噬细胞为CD11b^(-),且除红细胞外,部分EBI中存在CD11b^(+)细胞,与之前的研究相符。结果显示,该方法在没有造成EBI结构明显破坏的情况下,富集效果在去除单细胞以及非EBI细胞团等方面显著优于现有其他方法,适合对EBI纯度要求较高的研究,为造血微环境研究提供了有效的方法和手段。

Expression of B Locus Beta 2 (<i>BLB2</i>) Gene at Cytolytic and Latent Immune Response Stages of Immunocompetence in Nigerian Indigenous Chickens

An economically-important trait in poultry for which gene identification continues to be a challenge is immune response. The objective of the study was to quantitate the expression of major histocompatibility complex (MHC) class II BLB2 gene at cytolytic and latent immune response stages in Nigerian indigenous chickens. A total of 108 Nigerian indigenous chickens (NIC) were sourced across the South-western states in Nigeria. The birds were inoculated with sheep red blood cells (SRBC), after which blood samples were obtained (5 days post-inoculation) and antibody haemagglutination test was carried out to place the birds into groups of high and low antibody titre levels. The categorisation of the birds resulted in six groups of normal feather high, normal feather low, naked neck high, naked neck low, frizzle feather high and frizzle feather low antibody groups. A total of 48 chicks were selected from the progeny for gene expression studies. Surgical excision of thymus and spleen was carried out for the detection of cytolytic and latent responses of the birds. β-actin was used as the endogenous control and the critical threshold method (2–ΔΔCт) was carried out for the determination of fold change. The fold change of spleen tissue expression at cytolytic immune response of the birds was 30,362.44 compared to latent response 294.07;and the fold change of thymus expression at cytolytic immune response of the birds was 51.98 compared to latent response 5.24. At both cytolytic and latent stages of immune response to SRBC antigen, BLB2 expression in the spleen was comparatively higher than in the thymus and the height of transcriptional activity was associated with the cytolytic stage. The birds of high titre at both the cytolytic and the latent responses had higher mRNA expression. This study concluded that BLB2 gene expression in the Nigerian indigenous chicken was induced at the cytolytic stage and repressed at the latent stage. During avian infections, the category of high immune response birds would perform better than the low immune response counterpart;and the protective response that BLB2 gene offers will be repressed from one time point to the other.

中药免疫增强剂对鸡ILT疫苗免疫和强毒攻击的影响

选择健康仔鸡 70只 ,随机分为 7组 ,每组 10只。 1组为健康对照组 (不免疫、不攻毒 ) ,2～ 4组为不同处理的免疫试验组。在试验仔鸡 45日龄时 ,2组免疫传染性喉气管炎 (ILT)疫苗 ,3组免疫ILT疫苗同时肌肉注射中药免疫增强剂Ⅰ ,4组免疫ILT疫苗同时肌肉注射中药免疫增强剂Ⅱ。 5、6组为非免疫试验组。在仔鸡 5 2日龄时 ,5组肌肉注射中药免疫增强Ⅰ ,6组肌肉注射中药免疫增强Ⅱ。 7组为单纯强毒攻击组。 5 5日龄时 ,2～ 7组全部用ILT强毒 (EID50 =10 -5 33/ 0 1ml)攻击。结果显示 :试验 2组在免疫后 3d ,RBC -CRl和RBC -IC花环率显著降低 ,免疫后第 9d ,上述两个花环率恢复到正常值。试验 3、4组 ,RBC -CRl和RBC -IC花环率在免疫后升高 ,且高于 1组和 2组。强毒攻击后 5d、10d ,试验 2～ 6组 ,RBC -CRl、RBC -IC花环率仍然保持在攻毒前的水平。 7组的RBC -CRl和RBC -IC花环率显著降低 ,与其他各组比较差异极显著 (P <0 0 1) ,在攻毒后第 10d(试验 2、3、4组免疫后 2 0d) ,体内ILT抗体检测结果为 ,试验 1组ILT抗体全部阴性 ,其他试验组的ILT抗体效价为 :2组、3组、7组为 1∶8;4组、5组为 1∶32 ;6组为 1∶2 5 6。说明ILT疫苗免疫或强毒攻击 ,均会引起机体红细胞免疫功能降低 ;

传染性喉气管炎疫苗免疫对鸡红细胞免疫功能状态的影响

选择健康仔鸡 4 0只 ,随机分为 4组 ,每组 10只。Ⅰ组为健康对照组 ,Ⅱ～Ⅳ组为不同处理的试验组。在 4 5日龄时 ,Ⅱ组免疫传染性喉气管炎 (ILT)疫苗 ,Ⅲ组免疫ILT疫苗同时肌肉注射中药免疫增强剂Ⅰ ,Ⅳ组免疫ILT疫苗同时肌肉注射中药免疫增强剂Ⅱ。分别在免疫前 1天、免疫后第 3天和第 9天 ,测定各组鸡的红细胞免疫功能状态。结果发现 ,试验Ⅱ组的鸡在ILT疫苗免疫后 3天 ,RBC_CR1花环率和RBC_IC花环率显著降低 ,与其他各组比较差异极显著 (P <0 .0 1)。免疫后 9天 ,RBC_CR1花环率和RBC_IC花环率升高到正常水平 ;而Ⅲ组和Ⅳ组 ,免疫后RBC_CR1花环率高于Ⅰ组 (P <0 .0 1、P <0 .0 5 )。说明ILT疫苗免疫会引机体红细胞免疫功能的短暂性降低 ;

红细胞富集与多重RT-PCR联合检测禽流感病毒

目的对禽流感病毒H5、H7亚型进行更快速、更灵敏检测。方法根据禽流感病毒(AIV)核蛋白基因和血凝素基因设计3对特异性引物,建立在结合红细胞富集AIV病毒的基础上进行多重RT-PCR检测方法。结果该方法在1个反应体系中不仅能够鉴定A型流感病毒,而且可以同时确定是否为H5和H7亚型AIV;该方法的检测下限可达2.5pg的病毒RNA;对于参考毒株都可以扩增出预期大小的基因片段,而对新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的平行对照结果均呈阴性。结合AIV能够吸附鸡红细胞并在一定条件下解离的特点,利用鸡红细胞对48份已确诊样品进行病毒富集,然后用建立的多重RT-PCR方法检测富集产物结果显示48个样品中,30个为H5亚型AIV阳性,与病毒分离结果完全一致。结论由以上结果初步表明本研究建立的检测方法快速,特异,在禽流感临床筛检中显示出良好的应用前景。

祛风湿类中药免疫作用的研究——对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠免疫功能的影响

目的:研究祛风湿中药对环磷酰胺(CTX)所致免疫功能低下模型小鼠免疫功能的影响。方法:采用环磷酰胺建立小鼠免疫低下模型,测定灌胃给药后小鼠体内碳粒廓清水平和血清溶血素抗体水平。结果:四大类中药均有不同程度的提高免疫抑制小鼠碳粒廓清率,促进血清溶血素形成,在2个免疫增强作用的试验中,辛温(热)合归脾胃经药均表现出很强的免疫增强作用,其次是祛风湿强筋骨药也具有较强的免疫增强作用,另外2大类祛风湿止痹痛药和舒筋活络药有一定作用。结论:免疫作用可能是祛风湿中药的共同药理作用之一,辛温(热)合归脾胃经药表现出较强的免疫增强作用为临床应用提供了理论支持,同时完全支持提出将其归为第四类祛风湿中药的观点。

楮实子对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠免疫功能的影响

目的:研究楮实子对环磷酰胺模型小鼠免疫功能的影响。方法:以环磷酰胺制备小鼠免疫低下模型并结合体外药理实验,测定灌胃给药后小鼠体内巨噬细胞吞噬率、血清溶血素抗体水平,并观察植物血凝素诱导T淋巴细胞的增殖反应。采用含药血清体外培养小鼠腹腔巨噬细胞,MTT法考察巨噬细胞的活性,并观察体外培养的巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数。结果:楮实子提高免疫抑制小鼠碳粒廓清率,促进血清溶血素形成。结论:楮实子有提高免疫抑制小鼠免疫功能的作用,但未显示出促进T淋巴细胞增殖的作用。

聚乙二醇诱导鸡红细胞融合条件的优化

目的:探讨聚乙二醇诱导鸡红细胞融合最适条件。方法:以鸡红细胞为材料,聚乙二醇为诱导剂,从细胞密度、融合温度、聚乙二醇浓度及反应时间进行单因素实验,并设计3因素3水平的正交实验计算细胞融合率。结果:鸡红细胞融合的最佳条件是:细胞密度为2×106个/ml,聚乙二醇浓度为35%,反应温度为35℃,反应时间40min。结论:在该条件下,细胞融合率最高达33.06%。

不同浓度黄曲霉毒素B_1对雏鸡血液生理指标的影响

为探究不同浓度黄曲霉毒素B1(AFB1)对雏鸡造血功能的影响,将64只1日龄健康海兰褐雏鸡随机平均分成A、B、C、D 4组,连续饲喂含有不同浓度AFB1(0、2.8、4.2、5.6 mg/kg)的饲料,分别在7、14 d采血测定各组鸡外周血白细胞总数(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)和血小板(PLT)数目的变化并进行比较,取肝脏,称重后迅速固定,HE染色观察组织病理学变化,计算肝指数。试验期间未发现明显的中毒症状,但有轻微的贫血症状,14d内无受试动物死亡。连续饲喂7d,B、C、D组肝指数极显著高于对照A组(P<0.01),但其组间差异不显著。B组WBC数目显著低于对照组(P<0.05),而C、D组极显著低于对照组(P<0.01)。B、C、D组的RBC、HGB、HCT、PLT数目均极显著低于对照组(P<0.01);连续饲喂14 d,B、C、D组肝指数极显著高于对照A组(P<0.01),D组又极显著高于B、C组。B组WBC、RBC、HCT、PLT数目均显著低于对照组(P<0.05),B、C、D组HGB含量极显著低于对照组(P<0.01)。2.8 mg/kg AFB1能显著升高肝指数,肝脏肿大出血,轻度脂肪变性且浓度越高损伤越严重,而且显著降低雏鸡的血液生理指标(WBC、RBC、HGB、HCT、PLT),并呈现出一定的时间和剂量依赖性。

PEG诱导鸡红细胞融合影响因素探讨

细胞融合技术是近年来迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术,本研究以鸡红细胞为材料,以PEG(Mw=4000)为诱导剂,研究不同的PEG体积分数(0%、25%、50%、75%、100%),不同的融合时间(5 min1、0 min、15 min2、0 min2、5 min),不同的融合温度(20℃、30℃、35℃、38℃、40℃)对鸡红细胞融合率的影响.结果显示:PEG的体积分数为50%,融合时间为15 min,温度为38℃时融合的效果最好.

不同剂量柔嫩艾美耳球虫感染对雏鸡红细胞压积和血沉值的影响

试验应用1 0×103、1 0×104和5 0×1043个不同剂量的柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)孢子化卵囊,进行人工感染发病。对雏鸡感染后不同时间的红细胞压积容量(PCV)和红细胞沉降速率进行了测定。结果表明,一定剂量的柔嫩艾美耳球虫感染,可引起感染雏鸡红细胞压积容量降低(p<0 05,p<0 01),红细胞沉降速率加快(p<0 05,p<0 01)。随着感染剂量加大,两项指标的变化幅度也变大,且均以感染后的第5天时最为明显。

藏鸡胚胎血液学参数及尿囊绒毛膜血管密度分析

通过在不同海拔(西藏:2900m,北京:100m)对藏鸡和小型鸡(对照)胚胎的血液学参数和高原胚胎血管密度的测定,分析其在藏鸡胚胎高原适应性中的作用。结果表明:高原孵化第9天藏鸡胚胎尿囊绒毛膜(CAM)血管密度系数(VDI)比小型鸡胚胎低32.23%(P<0.05),孵化第12天后两者均无显著差异(P>0.05),说明高原孵化藏鸡胚胎在CAM毛细血管上并没有表现出比小型鸡更有利于气体交换的特征。藏鸡红细胞压积在高原孵化第12和15天显著高于小型鸡(P<0.05),而红细胞计数与小型鸡无显著差异,同一时期藏鸡胚胎的红细胞平均容积(MCV)和红细胞平均血红蛋白(MCH)都比小型鸡胚胎高,而红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)藏鸡胚胎低于小型鸡胚胎。说明在高原孵化藏鸡胚胎表现出较强的适应性,可能与体积较大、血红蛋白含量较高的原始型红细胞产生较多并且存在时间较长有关。

太行鸡脾脏SRBC免疫应答基因的筛选与分析

为筛选太行鸡脾脏组织中绵羊红细胞(sheep red blood cell,SRBC)免疫应答的关键基因和信号通路,本研究采用高通量测序技术,构建了太行鸡SRBC免疫组和对照组脾脏组织的数字基因表达谱,对差异表达的基因进行筛选与注释、GO分析和通路的功能显著性富集以及差异基因编码蛋白的互作网络分析。结果表明:太行鸡在免疫6 d后的SRBC抗体滴度平均值为7.653;与对照组相比,差异倍数在2倍以上的共有1 108个基因,其中496个上调表达,612个下调表达,412个上调基因只在免疫组表达,537个下调基因仅在对照组表达;上调基因主要涉及T细胞激活、淋巴细胞增殖和单核细胞增殖等生物学过程,下调基因主要参与免疫效应、防御效应、炎性效应、先天性免疫效应生物学过程;在分子注释系统数据库中注释到的免疫相关的显著调控通路有12条,包括抗原的加工递呈、Toll样受体信号通路、沙门氏菌感染、HTLV-Ⅰ感染和单纯疱疹病毒感染等;56个差异基因编码的蛋白产物存在相互作用,其中16个基因位于网络中心节点,部分差异基因与SRBC相关QTL重叠。初步认为抗原加工与递呈的MHCⅡ类分子途径、T细胞激活等调控通路及RAG2、FOS、MHC B-LBⅢ、HSP90AA1、CXCR4和HSPA8等基因可能是参与调控太行鸡SRBC免疫应答的重要信号通路和基因,但其功能和影响还有待于深入研究。

聚乙二醇诱导细胞融合影响因素探究

以鸡红血细胞为材料，聚乙二醇（Mr=4000）为诱导剂，研究不同的细胞密度、聚乙二醇体积分数、Ca^2＋浓度等因素对细胞融合率的影响，结果显示：细胞密度为（3．0～4．0）×10^4／mL，聚乙二醇的体积分数为50％，Ca^2＋浓度为50mmol／mL时融合效果最好，融合率高达29．76％．

鸡红细胞融合最适条件的探讨

目的:探讨快速、有效的细胞融合条件。方法:用鸡红细胞为材料,聚乙二醇(Mw=4000)为诱导剂,诱导鸡红细胞融合。结果:鸡红细胞融合的最适温度为39℃,最适时间为15min。结论:在该条件下,同时用Giemsa染液对融合细胞染色,实验观察效果明显。

二甲亚砜(MDSO)对血红细胞膜通透性增强作用的研究

通过7230分光光度计,测定不同物质环境情况下的鸡血红细胞溶液的透光率随时间的变化率,得出各物质对鸡血红细胞膜通透性水平。在测试二甲亚砜对甘油和尿素的通透性影响时发现:(1)不同浓度二甲亚砜的影响作用不同;(2)在鸡血中分别人1.1mL,1.8mL 二甲亚砜,可以使红细胞膜对甘油、尿素的通透性在瞬时内明显加强。(3)用纯二甲亚砜先处理则增强作用明显。

聚乙二醇诱导鸡红细胞融合实验方案的优化

目的:聚乙二醇(PEG)介导的细胞融合法是最为经济、简单的细胞融合技术,但受多种因素影响,实际实验效果并不理想,为获得高效稳定的细胞融合效率,本研究拟对PEG诱导的鸡红细胞的融合实验进行优化。方法:调整鸡红细胞的采集与保存方式、细胞浓度、缓冲系统(GKN与1640)、pH、诱导与孵育时间,以及染液的选择等。结果:弱碱PEG环境(pH≈7.8)下诱导与孵育时间均采用5min时,细胞融合率最高(17.87%),显著高于未调节pH组及诱导与孵育时间20min组(P<0.01);pH>8时,细胞聚集但胞膜皱缩破裂,计算融合率困难;亚甲基蓝、中性红染色时间>20min时,细胞膜亦皱缩破裂。结论:宜选择肝素类抗凝管采集及保存鸡血,在GKN或1640缓冲系统中,以全血与试剂1:9比例洗涤及孵育,弱碱PEG环境(pH≈7.8)分别诱导、孵育5min,并在20 min内观察亚甲基蓝或中性红染色结果,该方案适宜应用于PEG诱导的鸡红细胞融合实验教学。

关于开设细胞融合实验的探讨

利用化学物质聚乙醇对鸡红细胞进行细胞融合诱导.本文分别以分子量为3350和6000的聚乙二醇为诱导剂,诱导鸡红细胞融合;并通过改变PEG的pH值研究了不同pH值的PEG对细胞融合率的影响.结果表明:分子量为3350的融合率比6000的高,同为分子量3350的PEG,当其pH值为8.0时,其融合率较pH值为7.4时高.

不同生境中雏鸡外周血液红细胞微核率变化的研究

试验研究了不同生境中,不同日龄雏鸡外周血液红细胞微核率的变化,结果除1日龄雏鸡其外周血液红细胞微核率为0外, 其他日龄雏鸡其外周血液红细胞微核率皆大于0,且同一日龄但不同环境中饲养的雏鸡其外周血液红细胞微核率差异极显著。

砷对雏鸡红细胞免疫功能及血液免疫球蛋白的影响

试验将40只7日龄雏鸡分为3组,分别每日经口灌服不同浓度砷溶液和生理盐水,分别于8、10、14、17日龄测定血液红细胞免疫功能及血清中免疫球蛋白含量。结果显示,不同浓度的砷溶液均可以导致雏鸡RBC-C3bR花环率先升高(P>0.05)再降低(P<0.01或P<0.05),RBC-IC花环率先降低(P>0.05)再升高(P<0.01或P<0.05),血液中免疫球蛋白含量也是先微升高(P>0.05)再降低(P<0.01或P<0.05),且呈时间剂量效应。表明砷可影响雏鸡红细胞免疫功能及血清中免疫球蛋白的含量,降低雏鸡血液的免疫功能。