新型BTK PROTAC降解剂的设计合成及活性评价

目的设计合成系列以伊布替尼类似物为布鲁顿酪氨酸激酶(bruton′s tyrosine kinase,BTK)激酶配体的蛋白降解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimeras,PROTAC)降解剂,并初步评价其体外活性。方法以3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺为起始原料,通过取代、还原胺化、脱保护和水解等反应合成一系列新型PROTAC;通过MTS法和蛋白免疫印迹法(Western-blot)分别测定目标化合物对OCI-LY10细胞的增殖抑制能力和BTK降解活性;通过分子对接考察分子配体与BTK蛋白的结合模式。结果共合成了14个BTK PROTAC降解剂,大部分化合物都具有一定的体外活性,其中化合物15a表现出了较好的细胞增殖抑制活性(IC_(50)=7.15 nmol·L^(-1))和BTK降解活性(DC_(50)<10 nmol·L^(-1))。结论合成了结构新颖、活性较好的BTK PROTAC降解剂,对其构效关系进行了初步探索,可为BTK PROTAC降解剂的进一步研究提供参考。

介绍一款优秀的分子图形软件Chimera

为提高信息技术在化学科研教育中的应用,介绍了一款名为UCSF chimera的优秀的分子图形软件,其自由的可视化功能及其他附属工具使用方便,在生物、医药、化学的科研、教育等方面都有着广泛的用途。

新型布鲁顿氏酪氨酸激酶蛋白水解靶向嵌合体(BTK PROTAC)的设计合成及活性评价

目的 设计合成新型布鲁顿氏酪氨酸激酶蛋白水解靶向嵌合体(BTK PROTAC),并在体外评估这些分子对BTK蛋白的降解活性。方法 以Nurix Therapeutics公司临床化合物NX-5948为先导化合物,分析其与靶蛋白的相互作用,通过引入并环代替吡嗪胺的骨架跃迁思路对其进行结构改造,成功合成了一系列新型BTK PROTACs,通过时间分辨荧光共振能量转移技术(TR-FRET)、MTS法和蛋白质免疫印迹法分别测定目标化合物的激酶活性、细胞增殖抑制活性和BTK蛋白降解活性。结果 共合成6个目标化合物(化合物B~G),活性测试结果显示,大部分化合物都具有优异的细胞增殖抑制活性和BTK降解活性,其中化合物B表现出较优的BTK蛋白降解能力,其半数最大降解浓度(DC_(50))值约为0.1 nmol·L^(-1)。结论 基于NX-5948,通过骨架跃迁的方法设计合成了一类新颖的BTK PROTAC化合物,进行了构效关系的初步探索,可为BTK PROTAC降解剂的进一步研究提供参考。

基于PROTAC技术的EGFR降解剂的合成

表皮生长因子受体(EGFR)是治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的有效靶点,但获得性耐药极大地限制了EGFR小分子抑制剂的临床疗效。PROTAC技术有望通过蛋白降解克服耐药性问题。基于PROTAC技术设计并合成了6个靶向EGFR的降解剂,并进行了药理活性评价。Western blot测试结果显示化合物Ⅶ能有效地诱导EGFR^(del19/T790M/C797S)和EGFR^(L858R/T790M/C797S)突变蛋白的降解,细胞增殖抑制活性测试显示化合物Ⅶ能抑制Ba/F3-EGFR^(del19/T790M/C797S)和Ba/F3-EGFR^(L858R/T790M/C797S)细胞的增殖,半抑制浓度(IC_(50))值分别为8.072 nmol/L和7.675 nmol/L。

新型BTK-PROTAC分子的设计、合成及生物活性评价

蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)技术在新药研发领域越来越受到重视。基于NX-5948的靶蛋白配体(Warhead)结构,采用5-氟吲哚代替吡嗪胺的思路进行改造,成功合成化合物A。为研究不同连接子(Linker)和E3配体对蛋白降解活性的影响,成功设计合成了化合物B~F,化合物A~F结构均经^(1)H NMR和MS表征。通过蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)分别测定目标化合物布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)的降解活性。结果表明:化合物A、C、D、E、F都有近似于NX-5948的蛋白降解活性,其半数降解浓度(DC_(50))小于1 nM;并且所有目标化合物24 h最大降解程度(D_(max))均略优于NX-5948,为进一步化合物改造提供结构依据。

蛋白水解靶向嵌合体类药物及其潜在风险分析

目的介绍靶向蛋白质降解(TPD)技术中“蛋白水解靶向嵌合体(PROTACs)”技术的作用机制和设计原理,讨论现有基于PROTACs技术药物的潜在风险及解决方案,以期为新型、高效且安全性较高的PROTACs类药物研发提供参考。方法分析近年来已发表的相关文献信息,归纳PROTACs技术的作用机制、各组成部分的设计原理、已发现的潜在风险及已报道的应对策略。结果对PROTACs类药物的设计,多从靶蛋白结合分子的溶剂暴露区域选择合适的位点与连接链结合,同时该设计应基于高分辨率的晶体结构,并且应避免小分子与靶蛋白的结合亲和力发生变化;在E3连接酶及其配体选择上,多是先从使用较为广泛的CRBN和VHL连接酶配体开始进行逐步筛选;在连接链设计上,多是从柔性PEG类链开始筛选;在潜在风险上,PROTACs类药物存在如过度降解、脱靶毒性、Hook效应、代谢产物毒性、醛氧化酶参与代谢、linker断裂型产物毒性等问题。结论建议将PTOTACs化合物视为整体看待,灵活应用蛋白质组学等技术方法,预防与监测分析该类化合物的代谢产物毒性,为开发活性更好、安全性更高的PROT ACs药物奠定基础。

一种基于Chimera软件的分子动力学模拟方法

Chimera是用于分子结构和相关数据的交互式可视化和分析程序,可实现的功能有密度图,轨迹和序列比对等。然而,目前对于其在分子动力学模拟方面的应用还没有详细的阐述。因此,本文拟详细介绍应用Chimera软件进行分子动力学模拟的流程,这将促进其在生物、医药、化学的科研、教育等方面的应用进而推动这些领域的发展。

VP60 loop区的突变对RHDV VLP功能的影响

[目的]从病毒样颗粒（VLP）的形成、血凝特性以及受体组织血型抗原（HBGA）结合特性方面,分析VP60 loop区在兔出血症病毒（RHDV）VLP功能中的作用。[方法]针对RHDV VP60蛋白的loop区411-417位氨基酸对应的基因设计引物,通过SOE法将411-417位氨基酸等量替换成柔性氨基酸GSGGSGG,获得重组基因VP60-411-417,利用杆状病毒表达系统获得重组病毒r Ac-VP60-411-417。将重组病毒接种Sf9细胞,通过IFA、SDS-PAGE和Western blot等方法证明嵌合蛋白P411-417的表达。通过负染透射电镜观察嵌合蛋白VLP的形成,利用血凝试验分析嵌合蛋白的血凝特性,利用合成多糖结合试验分析嵌合蛋白的受体结合特性。[结果]Western blot、IFA和负染透射电镜试验结果显示,嵌合蛋白P411-417得到有效表达,且能够形成完整的VLP;合成多糖结合试验结果显示,嵌合蛋白能够特异性结合HBGA,但其血凝特性消失。[结论]411-417位氨基酸的突变显著影响RHDV的血凝特性,不影响VLP的形成以及结合HBGA的能力,说明该区域是血凝特性的相关位点,但不是HBGA受体结合的关键位点。

转录介导融合基因RBM6-RBM5在肿瘤细胞及组织中的表达

目的:鉴定RBM6-RBM5融合基因的存在,研究其与肿瘤发生的关系。方法:采用GLC20、MDA、MB、231、Jurkat、TF-1、MCF-7、Hela、BT-474、A431、K562及Raji10种肿瘤细胞株,肺、卵巢、骨骼肌、皮肤、脾脏、子宫、心脏、骨、脑、淋巴结、胰腺、前列腺及睾丸等肿瘤组织及其相应正常对照组织的cDNA,5例乳腺癌组织,以巢式PCR方法检测融合基因的存在,并通过QPCR方法研究融合基因的产生与RBM6、RBM5基因表达水平之间的关系。结果:RBM6-RBM5融合基因首次在MDA、MB、231细胞株中获得鉴定,序列分析发现该基因为RBM6和RBM5的融合体,该融合体不包括RBM6的外显子20、21以及RBM5的外显子1。该融合基因在10种肿瘤细胞株及部分肿瘤组织中表达,但在正常组织中却未见表达。融合基因的表达与RBM6和RBM5 mRNA的表达有关;RBM6和RBM5 mRNA的表达水平在融合基因阳性的肿瘤组织中明显高于融合基因阴性的肿瘤组织。结论:融合基因的表达与肿瘤发生有关,高水平的RBM6和RBM5 mRNA水平可能是融合基因产生的原因之一。

花鲈胚胎干细胞移植及嵌合体的构建

旨在通过花鲈胚胎干细胞（LJESl）移植构建嵌合体，证实LJES1细胞的体内分化能力和发育全能性。采用脂质体介导法将线性化pCMV-EGFP质粒导入到长期培养的LJES1细胞内，细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达率为5％～10％，以此为供体，通过显微注射方法把20—50个LJES1细胞移植到花鲈囊胚中，共移植囊胚478枚，获得了20枚表达GFP的嵌合体胚胎，其中的15枚胚胎发育成鱼苗。荧光显微观察和PCR检测显示了LJES1细胞可在宿主胚胎内片状嵌合和单细胞分散嵌合，嵌合部位可分布于胚体的三个胚层；同时也证明GFP是一种优良的遗传标记。本实验结果为证实LJES1细胞的发育全能性提供了有力证据。

应用成人骨髓间充质干细胞建立人-猴肝脏嵌合体

背景:建立人骨髓间充质干细胞与猴的嵌合体肝脏对研究干细胞体内增殖与分化具有重要意义。目的:应用成人骨髓间充质干细胞建立人-猴肝脏嵌合体动物模型。方法:分离成人骨髓间充质干细胞,纯化并培养至6代,使细胞量大于5×108。转染绿色荧光蛋白基因标记后在B超引导下移植到妊娠10周的胎猴肝脏中,幼猴出生后1个月和3个月,穿刺取肝脏组织活检,切片后荧光显微镜观察带绿色荧光的人源细胞数量及分布,免疫组织化学染色法检测人白蛋白的表达。结果与结论:荧光显微镜观察发现,幼猴出生后1个月及3个月均发现有人源骨髓间充质干细胞在肝脏内存活,并发生迁移,分布趋向于集中。免疫组织化学检测发现,幼猴出生后1个月及3个月肝脏内有表达人白蛋白的细胞存在,分布与带有绿色荧光的细胞较为一致。提示应用成人骨髓间充质干细胞在猴胚胎早期能够建立人-猴肝脏嵌合体,人源性骨髓间充质干细胞可在猴肝中分化成具有合成白蛋白功能的细胞。

PROTACs在肿瘤治疗领域的研究与应用

蛋白水解靶向嵌合分子(protein proteolysis-targeting chimeras,PROTACs)是一种可以直接降解靶蛋白的双功能嵌合体。PROTACs通过中间连接链将靶蛋白与E3泛素连接酶结合的配体连接起来,继而泛素化修饰靶蛋白,从而使其进入蛋白酶体途径降解。根据PROTACs的作用机理,可以设计合成靶向降解调控肿瘤发生发展相关蛋白的PROTAC分子,从而达到治疗肿瘤的效果。目前,多个靶向肿瘤相关蛋白(BET蛋白、TBK1、CDK4/6以及AR、ER等)的PROTAC分子已在体外和体内实验中表现出良好的作用效果,有望研究开发成为肿瘤靶向药物。本文将对PROTACs的发展及其在肿瘤治疗领域的应用进行述评。

具重复Kringle结构分子的缺失体和嵌合体的构建方法

确定肝细胞生长因子(HGF)和巨噬细胞刺激蛋白(MSP)各4个Kringle结构的共有序列并设计公用引物,此公用引物配合HGF和MSP上、下游引物,利用DNA聚合酶链式反应(PCR)技术,可在一次PCR反应中扩增出多条片段,以不同的组合方式将这些片段两两连接,得到了缺失不同Kringle的缺失体和两种分子间不同区域的缺失型嵌合体,从而为HGF和MSP结构与功能的研究奠定了基础。此方法可普遍适用于含有两个或两个以上Kringle分子的缺失体与嵌合体的构建。克隆过程中对存在引物酶切位点的cDNA片段的克隆方法的建立,为同类问题的解决提供了可靠的方法。

嵌合体外周血细胞异源性补体调节蛋白检测的意义

目的通过流式细胞术检测人源性补体调节蛋白(hCD55和hCD59)在人脐血干细胞嵌合体大鼠外周血细胞中的分布,分析探讨嵌合体供者诱导异种移植免疫耐受的可能机制。方法采用宫内胎鼠移植加新生鼠肝内注射人脐血干细胞的方法,制作人脐血干细胞嵌合体大鼠模型。4周后利用流式细胞三色标记法,对hCD45/SSC设门时,不同区域内hCD55和hCD59抗原阳性细胞的分布进行分析。利用补体依赖性淋巴细胞毒性反应,评估嵌合体淋巴细胞的免疫适应性。结果hCD45/SSC设门时,在hCD45阳性细胞区域中,hCD55和hCD59阳性率分别高达(53.69±18.23)%和(31.8±27.5)%,但仅占全细胞总数的(2.0±1.32)%和(0.76±0.56)%,与全细胞区域中hCD55和hCD59阳性细胞的百分率(4.11%±2.83)%和(2.82±1.38%)相比,差异具有显著性意义(t=2.71,P=0.043;t=3.64,P=0.015)。嵌合体大鼠补体依赖性淋巴细胞毒性反应为(22.32±15.10)%,低于非嵌合体组大鼠的(57.29±22.65)%,差异具有非常显著性意义(t=4.16,P<0.001)。相关分析显示,嵌合体大鼠补体依赖性淋巴细胞毒性反应与外周血hCD55阳性细胞百分率呈负相关(r=-0.679,P=0.031);外周血hCD55阳性细胞百分率和hCD45阳性细胞百分率呈正相关(r=0.658,P=0.038)。结论人脐血干细胞嵌合体内人源性细胞能够表达人补体调节蛋白。人造血细胞嵌合体淋巴细胞具有抵抗人补体对细胞融解、破坏的作用。随着嵌合体嵌合比例的增加,人源性补体调节蛋白表达增多,嵌合体外周血淋巴细胞抵抗人补体的融解、破坏作用增强。嵌合体内异种补体调节蛋白的存在,可能是造血细胞嵌合体供者诱导异种移植免疫耐受的基础。

诱导蛋白降解的小分子PROTACS的研究进展

靶向蛋白降解嵌合分子(PROTACs)是一类能够通过诱导靶蛋白的多聚泛素化而导致靶蛋白降解的小分子化合物,本文对采用不同E3泛素连接酶设计的PROTACs进行了介绍。

蛋白水解靶向嵌合体在白血病靶向治疗中的研究进展

蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)是一种双功能分子,通过使靶蛋白(POI)泛素化,继而使其在蛋白酶体中降解,这种蛋白降解机制已广泛用于与疾病相关的蛋白质降解中。利用PROTAC的靶向蛋白质降解可能会成为白血病靶向治疗中药物研发的新方向。本文将介绍PROTAC的研究进展及其在白血病靶向治疗中的应用。

鸡恒定链活性片段和NDVF蛋白表位嵌合体的构建与鉴定

[目的]为研究基于恒定链(Ii)分子片段的免疫载体提供试验材料。[方法]利用鸡恒定链的部分有免疫活性的片段作为免疫载体结构,构建含新城疫病毒F蛋白抗原片段的嵌合体。[结果]成功构建了Ii-key/F306、Ii-key/F306/AP、Cyt/Ii-key/F306和Cyt/Ii-key/F306/AP 4个嵌合体。重组质粒能被诱导表达相应蛋白分子,而且通过纯化获得95%高纯度。[结论]该试验中嵌合体的成功制备为动物免疫试验奠定了基础。

罕见46,XY/47,XYY嵌合体型女性患者病因诊断的遗传咨询模式探讨

目的:报道1例46,XY/47,XYY嵌合体女性性反转,探讨其病因诊断路径,提供临床的遗传咨询。方法:临床特征分析和家系调查。采用外周血淋巴细胞核型分析技术进行染色体核型分析,同时基于二代测序技术(NGS)的全基因组拷贝数变异测序(CNV-seq)进行外周血标本拷贝数变异检测及性别决定基因(SRY基因)及AZF基因位点检测。结果:家系调查表明,该患者具有伴X隐性遗传模式;临床上呈现共外显性特征;社会性别为女性,患者的外周血染色体核型结果为46,XY[57%]/47,XYY[13%],染色体拷贝数变异检测示:Arr[hg19]46,XY[70%]/47,XYY[30%],Yp11.31-q11.223×3,dup(6)(q14.1),SRY基因检测阳性,AZF基因所检测位点均未见缺失。结论:细胞遗传学染色体核型分析技术及CNV-seq均可确诊46,XY/47,XYY嵌合体女性性反转综合征,其遗传病因可能为DAX-1基因表达异常。整合了针对46,XY性反转快速诊断路径的遗传咨询模式,供临床参考。

木聚糖酶和纤维素酶多酶嵌合体的构建

为探究木聚糖酶和纤维素酶形成的多酶嵌合体降解纤维素的效果,此研究设计了2个含有不同来源锚定域的重组木聚糖酶基因和重组纤维素酶基因,并设计了含有2个不同来源的粘附域和纤维素结合域的脚手架蛋白基因,体外构建了大肠杆菌E.coil BL21(DE3)表达载体,表达纯化了脚手架蛋白、重组木聚糖酶和纤维素酶。同时,体外组装三种元件形成多酶嵌合体,以微晶粉末纤维素为底物检测其降解纤维素的效率。结果显示,纯化所得的脚手架蛋白Scaf、重组木聚糖酶Xyn10B和纤维素酶Cel48F可在体外组装形成多酶嵌合体,该多酶嵌合体酶活(0.107±0.013 U/mL)显著高于游离酶混合物的酶活(0.084±0.001 U/mL)(P<0.05)。试验表明木聚糖酶Xyn10B和纤维素酶Cel48F可与脚手架蛋白Scaf体外组装形成多酶嵌合体,并可实现对纤维素的高效降解。

基于蛋白降解靶向嵌合体技术的分子胶降解剂的研究进展

包括肿瘤在内的许多疾病都是由特定的致病蛋白积累引起,降解致病蛋白或阻断致病蛋白活性,可抑制肿瘤的发生。但很多致病蛋白缺乏酶活性或缺乏药物作用的结合位点,致使很多小分子药物对肿瘤无能为力。以CR8为代表的分子胶降解剂是一类能够捕获这些“不可成药”蛋白并将其迅速降解清除的蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)。基于PROTAC技术诱导靶蛋白降解的策略,成为新药开发的研究热点。本文概述了PROTAC分子的结构特点及其在蛋白降解过程的作用,并根据作用靶点的不同,对基于PROTAC技术的分子胶降解剂的研究进展进行了综述,期望为新型分子胶降解剂的研究提供参考。