应用于dPCR基因芯片的荧光精缩无限远物镜设计

数字聚合酶链式反应(dPCR)技术在生物医疗领域具有非常重要的应用价值,为了进一步投入临床诊断和病原体检测中需要在光学检测系统的检测效率和准确性方面取得进展。针对dPCR检测需求,使用ZEMAX软件设计了无限远消色差荧光精缩物镜。镜头物方数值孔径为0.1,整体放大倍率为-0.65倍,可对Φ为34.9mm的物体进行成像,物方工作距离105.3mm,像方传递函数在70lp/mm处高于0.73,相对畸变小于0.4%;镜头设计可以同时满足大视场高分辨率的荧光多通道探测要求;基于无限远荧光显微成像技术,镜头可一次性检测位于28mm×18mm基因芯片上2万个反应通道,克服现有设备拼接成像的弊端并提高检测效率。

数字PCR技术的发展和应用

数字PCR(digital PCR,dPCR)技术作为一种全新的核酸检测方法,通过把反应体系均分到大量反应单元中独立地进行PCR,并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸数量。目前dPCR主要分为微滴式和芯片式两种。与传统PCR技术相比,dPCR具有高灵敏度、高精确度、高耐受性和绝对定量的优点。因此,dPCR技术在近年来得到了迅速的发展,广泛地应用于稀有突变检测、拷贝数变异分析和复杂样本基因表达检测等方面。

基于图像拼接的高通量数字PCR荧光基因芯片读取系统的设计

针对高通量数字聚合酶链式反应荧光基因芯片检测的需求,提出了一种基于荧光显微光学技术的基因芯片检测系统。系统以无限远荧光显微系统为框架,通过制冷CCD一次完成较大视场的成像,顺序移动基因芯片得到全部图像,通过图像拼接完成检测,切换二向色镜组实现检测不同荧光通道的目的。光学系统分辨率可达16.3μm、曝光时间500ms,目前只需要拼接35次,即可在1min内完成对28mm×16mm的基因芯片内两万多荧光通道的检测,极大的提高了检测效率。

新型十万目六边形微腔芯片数字PCR对肺癌基因突变的绝对定量分析

目的以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)G719S突变为对象,建立用于肺癌基因突变绝对定量分析的新型十万目六边形微腔芯片(novel 100000 hexagonal microchamber chip,NHMC)数字PCR(digital PCR,dPCR)平台。方法首先构建并优化适用于EGFR G719S突变的PCR检测体系;然后用NHMC-dPCR平台检测8个浓度梯度的EGFR G719S标准品质粒和4种干扰物质,评估该方法的灵敏度、特异性和抗干扰能力;最后分别用NHMC-dPCR、液滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)和DNA测序法检测6例EGFR G719X突变的肺癌组织样本,验证NHMC-dPCR在临床样本检测中的可靠性。结果NHMC-dPCR对EGFR G719S的最低检测浓度为3.01 copies/μL,检测值与期望值的线性方程为Y=0.725X-0.581,相关系数R^(2)=0.984。该平台检测4种干扰物未发现阳性拷贝,检测G719S突变及其与4种干扰物混合的结果分别为23194.4 copies和22095.7 copies。NHMC-dPCR、ddPCR和DNA测序3种方法检测6例临床样本的定性结果符合率为100%,其中2例由NHMC-dPCR定量的结果为1822.4 copies和451.7 copies,其对应由ddPCR定量的结果为1581.8 copies和218.3 copies。结论本研究建立的核酸绝对定量技术——NHMC-dPCR具有成本低、操作简单、速度快、抗干扰能力强等优点,可用于肺癌基因突变的绝对定量分析。

聚二甲基硅氧烷球形微腔阵列的数字PCR芯片

数字聚合酶链式反应(d PCR)技术是一种核酸绝对定量技术,但现有d PCR平台因其昂贵的设备或复杂的操作限制了其实际应用。利用气体膨胀浇注成型技术,结合集成微腔阵列的模具,设计、制作了一种成本低廉、简单可靠的d PCR微流控芯片。独特的球形微腔为液滴存储提供了更稳定的几何形式,保证了样品数字离散化的可靠性和稳定性。同时,芯片还利用预脱气的聚二甲基硅氧烷(PDMS)实现自动进样和样品离散化,大大降低了对复杂昂贵设备的依赖,且提供了更高集成度。利用芯片进行了EGFR基因第19号外显子数字PCR定量检测,验证了该芯片的实用性。