cpSSR: a New Tool to Analyze Chloroplast Genome of Citrus Somatic Hybrids

Chloroplast simple sequence repeat (cpSSR) markers in Citrus were developed and successfully used to analyze chloroplast genome inheritance of Citrus somatic hybrids. Twenty-two previously reported cpSSR primer pairs from pine (Pinus thunbergii Parl.), rice (Otyza sativa L.) and tobacco (Nicotiana tabacum L.) were tested in Citrus, nine of which could amplify intensive PCR products by agarose gel electrophoresis. Chloroplast genome inheritance of Citrus somatic hybrids from nine fusions was then analyzed, and five of the nine pre-screened primer pairs showed polymorphisms by polyacrylamide gel electrophoresis. The results revealed the random inheritance nature of chloroplast genome in all analyzed Citrus somatic hybrids, which was in agreement with previous reports based on RFLP or CAPS analyses. It was also shown that cpSSR is a more efficient tool in chloroplast genome analyses of somatic hybrids in higher plants, compared with the conventional RFLP or CAPS analyses.

蕨麻cpSSR序列特征分析

基于NCBI数据库中收录的蕨麻叶绿体基因组序列,利用REPuter软件和MISA软件分析其微卫星分布规律。结果显示,在叶绿体基因组中共检测到34个散在重复序列,22个分布在LSC区,10个分布在IR区,2个分布在SSC区。使用MISA共注释到92个SSR位点,平均每1820 bp出现1个SSR位点。SSR主要分布在LSC区(79.07%),重复序列主要以单碱基为主,占总数量的86.05%。微卫星长度平均为12 bp,大多数长度为10 bp,说明蕨麻中重复基元较短的微卫星变异速率较快。

叶绿体基因组微卫星标记(cpSSR)研究进展

随着测序技术的发展,叶绿体基因组微卫星标记(cpSSRs)的开发和应用越来越普遍。该研究介绍了叶绿体基因组分子标记的特点、用途、开发方法以及已开发的cpSSRs所具有的特点。随着cpSSRs开发成本的降低及研究技术的成熟,新的cpSSRs不断开发,将会有越来越多的叶绿体基因组SSR分子标记应用于群体遗传学、生物地理学和杂交育种的研究。其在野生植物进化过程研究中所具备的潜力在不久的将来将被充分认识和利用。

利用SSR标记研究甘蓝型油菜叶绿体基因组DNA多态性

叶绿体基因组具有母性遗传、单倍性、高度的保守性和明显的种内差异等特点。研究不同品种叶绿体基因多样化程度,可为甘蓝型油菜的收集与引种及遗传改良提供指导。利用15对特异性叶绿体SSR标记对287份国内外甘蓝型油菜叶绿体基因组多样性进行了分析,结果显示,在15对叶绿体SSR特异引物中,5对引物扩增产生多态性条带合计19条,平均每对引物检测出3.8条多态性条带;287份材料共划分成14个单倍型,优势单倍型H01占比74.91%、H02占比13.59%、H03占比4.88%,其余11种单倍型(H04-H14)占比合计6.62%;H02为波里马、陕2A胞质类型,为中国特有单倍型;国外甘蓝型油菜中,俄罗斯与瑞典的单倍型较丰富,引进俄罗斯与瑞典的资源能更高效拓宽中国甘蓝型油菜的遗传多样性本底。本研究还获得2对引物(MF-4和ccmp2)得到特异条带,并为此建立了快速鉴定波里马、陕2A胞质类型的方法,为波里马与陕2A细胞质类型材料的鉴定与保护提供了方法。

基于cpInDel标记和cpSSR标记的柑橘属及近缘属植物亲缘关系

【目的】通过对柑橘叶绿体基因组变异位点的研究,从胞质层面揭示柑橘类果树的遗传进化,为柑橘种质资源的收集、评价和利用提供参考。【方法】以甜橙叶绿体高变区序列为参考,利用已发表的二代基因组测序数据对代表性的柑橘属及其近缘属材料进行De Novo组装,获得叶绿体基因组高变区组装序列,通过序列比对,发掘代表性材料的差异位点,针对差异位点设计cpInDel引物。对甜橙叶绿体基因组两个及以上核苷酸重复构成的SSR位点进行定位分析,找出代表性材料间有差异的位点,针对差异位点设计cpSSR引物。选择在分类学和/或起源研究上有代表性的柑橘属及近缘属材料48份,利用新开发的cpInDel、cpSSR标记和已报道的cpSSR标记进行扩增检测、电泳谱带分析和聚类分析。【结果】本研究新开发4个cpInDel标记和13个cpSSR标记。扩增检测显示,这些标记在48份试验材料中均能扩增出较为清晰的多态性条带;但cpInDel标记扩增出的条带更为单一,类群区分时,仅通过单个标记便能实现对某一类群或几个类群的区分,具有更好的区分效果。聚类分析显示,cpInDel和cpSSR标记得到了比较类似的结果,但在小类群关系以及部分材料的归类上存在差异。二者均揭示枸橼类柠檬-藜檬-来檬杂种的胞质来源并非香橼,枳杂种的胞质也并非枳,显示宽皮柑橘类黄柑的代表性品种‘旺苍皱皮柑’有不同于宽皮柑橘类其他品种的胞质来源,‘资阳香橙’和‘韩国香橙’胞质差异明显。针对宽皮柑橘类、甜橙-酸橙类和宜昌橙-大翼橙类3个小类群的相互关系,cpInDel显示它们关系较近,而cpSSR则将它们归为独立的类群;cpInDel标记将印度野橘归于真正的枸橼类,cpSSR将其单独聚为一类。【结论】叶绿体基因组分子标记分析能从胞质角度揭示不同于核基因组的柑橘属及近缘属植物的亲缘关系,但若与核基因组分子标记分析相结合,能更全面地揭示材料间的亲缘关系,更准确地鉴定柑橘种质资源。

花椒cpSSR标记开发及在种间、种内的通用性分析

叶绿体基因组为母系遗传,保守性高,因此叶绿体基因组中的简单序列重复(SSR)标记可在更高分类水平上进行种质资源鉴定和群体遗传结构分析。利用TRF软件和SSR Hunter软件相结合对花椒Zanthoxylum bungeanum叶绿体基因组中的SSR位点进行筛选。结果显示:花椒叶绿体基因组中共有144个SSR位点,位点间的平均分布距离为1 100.00 bp。基于检测软件设置参数,SSR重复类型主要集中在一、三核苷酸重复,二者占SSR位点总数的91.67%。此外,随机设计合成30对SSR引物对10份花椒种质、5份竹叶花椒Zanthoxylum armatum种质和1份日本花椒Zanthoxylum piperitum种质进行PCR扩增检测,共筛选出10对多态性引物,其中单核苷酸重复位点的多态性高于多核苷酸重复位点。本研究开发的叶绿体SSR标记可有效区分花椒、竹叶花椒和日本花椒,但在花椒种内并未检测出多态性。表明花椒叶绿体基因组的SSR标记可用于花椒属Zanthoxylum不同种间的遗传多样性分析。

西藏工布乌头遗传多样性的cpSSR分析

为了研究西藏工布乌头（Aconitum kongboense L.）种质的遗传多样性,探讨西藏工布乌头的亲缘关系,试验采用叶绿体微卫星（cpSSR）分子标记技术对西藏工布乌头的遗传多样性进行分析。结果表明：通过筛选得到6对cpSSR引物,其中2对引物的扩增片段显示有突变位点。15份西藏工布乌头非编码区trnS-trnfM多态性最高,其单倍型多样性（Hd）、核苷酸多样性（Pi）分别为0.467,0.000 73。Tajima’s D检验中所有区域的D值均未达到显著水平（P〉0.05）,自然选择对这些突变并不起作用。HAP3与HAP1、HAP2、HAP4的亲缘关系都比较远。说明西藏工布乌头种质的遗传多样性较低,加查县崔久乡和浪卡子县卡热乡两个地区的野生工布乌头显示出较近的亲缘关系。

2种楠属植物叶绿体基因组特征及系统发育

应用Illumina Novaseq 6000高通量测序平台进行测序,组装了完整的崖楠(Phoebe yaiensis)和红毛山楠(Phoebe hungmoensis)叶绿体基因组,并对其基因组特征、基因构成、序列重复、边界收缩、密码子偏好性及系统发育进行分析。结果表明:崖楠和红毛山楠叶绿体基因组呈现典型的四分结构,总长度分别为154144和152671 bp,2种植物叶绿体基因组注释了包含83个编码蛋白、36个tRNA和8个rRNA在内的共127条基因,均检测到118个SSR位点。密码子偏好性分析显示,均有31个高频密码子,且都偏好以A/T结尾;与近缘种叶绿体基因组对比分析发现2种植物叶绿体基因组序列都高度保守;楠属植物叶绿体基因的Ka/Ks值基本小于1,rpl16基因在所有楠属基因组相互对比组合中为正选择,可能与楠属植物对环境的适应性有关。系统发育关系显示,楠属分为3个聚类组,崖楠与粗柄楠、白楠聚为一类;红毛山楠与粉叶楠、大果楠聚为一类;竹叶楠与楠属亲缘关系比润楠属更近。

落葵叶绿体基因组特征分析

【目的】落葵(Basella alba)为落葵科落葵属缠绕茎生草本植物,原产于中国和印度。植物叶绿体基因组遗传稳定,常被用于植物的鉴定及系统发育研究,旨在对落葵的叶绿体基因组进行特征分析。【方法】采用15对叶绿体基因组通用引物对落葵新鲜叶片提取的DNA进行扩增,并利用Illumina HiSeq X Ten平台进行测序,获得其叶绿体基因组序列。【结果】落葵叶绿体基因组全长156 533 bp,具有典型的四分体结构,包含83个编码蛋白基因、28个tRNA基因以及4个rRNA基因。检测到基因组中45个重复序列和263个简单重复序列,二核苷酸序列均为碱基AT/AT重复。密码子分析表明落葵叶绿体基因组密码子第三位碱基偏好使用A或U,综合中性绘图分析、ENC标准曲线分析、PR2-plot分析发现落葵叶绿体基因组密码子偏好性受自然选择因素为主的多种因素共同影响,符合落葵为双子叶植物的形态学分类结果。【结论】落葵与落葵薯叶绿体基因组高度相似,比较基因组学分析显示落葵与其他石竹目物种在反向重复区的收缩与扩张上存在差异。基于落葵在内的20种不同植物叶绿体基因组matK基因序列进行系统发育分析,结果表明落葵与其他落葵科植物处于同一进化分支,但其属间进化关系与形态学分类存在一定差异。研究结果为落葵科的资源分析及利用研究提供了理论基础。

六倍体小麦(AABBDD)及其近缘种属野生二粒小麦和粗山羊草叶绿体SSR遗传差异研究

【目的】系统分析不同小麦种的细胞质基因组遗传差异,用以发掘和利用新的小麦种质资源。【方法】采用24个叶绿体基因组微卫星分子标记,对普通小麦(TriticumaestivumL.)、斯卑尔脱小麦(Triticum speltaL.)、密穗小麦(Triticum compactum Host.)和中国特有小麦(新疆稻麦T.petropavlavskyi、西藏半野生小麦T.tibetanum和云南铁壳麦T.yunnanense)等不同类型六倍体小麦(AABBDD)叶绿体基因组的遗传多样性进行比较分析。【结果】与普通小麦相比,斯卑尔脱小麦和西藏半野生小麦等群体内的叶绿体遗传变异更丰富,可以作为普通小麦新的细胞质遗传变异来源;与粗山羊草相比,野生二粒小麦与六倍体小麦间存在更近的亲缘关系,这与前人关于二粒小麦是六倍体细胞质供体的研究结果相印证;研究还发现,新疆稻麦与普通小麦在叶绿体基因组上具有很近的亲缘关系,为新疆稻麦是由波兰小麦与普通小麦杂交再由普通小麦回交后产生的假说提供了分子水平上的证据。【结论】斯卑尔脱小麦和西藏半野生小麦等群体内的叶绿体遗传变异比普通小麦更丰富;野生二粒小麦与六倍体小麦以及新疆稻麦与普通小麦之间具有很近的亲缘关系,为不同小麦种的遗传差异提供依据。

烟草叶绿体基因组和线粒体基因组SSR位点分析

利用生物信息学方法对烟草叶绿体和线粒体基因组数据中的SSR信息进行了分析。结果表明,在叶绿体和线粒体基因组中分别获得186和578个SSR位点,SSR间的平均距离分别为838bp和745bp。在SSR的分布区域上,绝大多数SSR位点分布在UTR(尤其是5′UTR)区域;在SSR重复碱基类型上,主要集中在二、三碱基重复,二者占总SSR位点的90%以上,其中三碱基重复类型丰度最高。利用全部657对SSR引物在供试的10份烟草材料中进行扩增,发现所有引物均能获得目的片段,但在普通烟草内品种间并未检测到多态性,而在烟草种间有26对叶绿体基因组SSR引物和178对线粒体基因组SSR引物扩增出多态性条带,表明来源于烟草叶绿体基因组和线粒体基因组的SSR标记适合用于烟草种间进化、分类、遗传多样性等方面研究。

K、V、T型小麦细胞质雄性不育系叶绿体DNA的SSR分析及RuBP羧化酶活性比较

为了探讨小麦细胞质雄性不育(CMS)与叶绿体DNA(cpDNA)的关系,揭示CMS机理。以2套K、V、T型同核异质不育系(A)及其保持系(B)‘太911289’和‘冀5418’、育性恢复的F_1和各自的质供体粘果山羊草(Aegilops kotschyi)、偏凸山羊草(Aegilops ventricosa)、提莫菲维小麦(Triticum timopheevii)为试验材料,利用cpSSR引物对小麦cpDNA进行比较分析,筛选出代表不同胞质不育系的引物,探讨CMS与叶绿体的关系;同时测定由叶绿体DNA与核DNA共同编码的RuBP羧化酶的活性,为小麦K、V、T雄性不育类型的应用提供理论依据。结果表明:(1)K型、V型、T型不育系与保持系的cpDNA之间均呈现多态性,且不同的细胞质之间存在特异片段,这从DNA水平上提供了3类不育系胞质来源不同的证据,并分别找到5对和7对可以鉴定V型和T型不育系的特异引物。(2)除K型‘冀5418’与其胞质供体的cpDNA出现差异外,不育系与其胞质供体的cpDNA没有差异,而且不育系与其育性恢复的F_1代cpSSR扩增片段之间也没有差异,很好地遗传了其母本性状。(3)在起身期和开花期,不仅2套不育系的RuBP羧化酶活性显著高于保持系,且在不育系与恢复系杂交的F_1中,随着育性的恢复其RuBP羧化酶活性高于保持系而低于各自不育系;而在拔节期的不育系与保持系之间、不育系之间、以及F_1代与不育系和保持系之间的RuBP酶活性大小没有显著差异。这可能与拔节期主要是营养生长有关系。

柑橘体细胞胞质遗传及叶绿体SSR引物开发

以38个组合的柑橘体细胞杂种（或胞质杂种）为试验材料,综合应用RFLP、CAPS和cpSSR分子标记技术,对这些杂种的线粒体和叶绿体遗传组成进行了分析;同时对试验技术体系进行了完善与拓展,开发了柑橘叶绿体SSR标记;并对柑橘愈伤组织长期继代保存过程中胞质基因组遗传变异进行了分析,主要结果如下：

黑果枸杞叶绿体基因组特征分析

为揭示黑果枸杞叶绿体基因组(cpDNA)特征及系统发育规律,采用二代测序技术对黑果枸杞叶绿体进行测序,并分析其基因组特征。结果表明:黑果枸杞cpDNA全长154979 bp,其中包括1个大单拷贝区LSC,长度为85984 bp,1个小单拷贝区SSC,长18205 bp和2个反向互补重复区(IRs,25395 bp)。共注释到125个基因,其中,81个蛋白编码基因(CDS),36个tRNA基因,8个rRNA基因。共检测到60个核苷酸重复序列,有5种核苷酸类型,其中单核苷酸重复最多,为38个,占总体数的63.33%,基因序列为A/T。密码子偏好性研究显示,黑果枸杞cpDNA偏好G或C碱基,其中编码亮氨酸(Leu)的密码子最多,为2154个,占总数的10.57%;编码半胱氨酸(Cys)的密码子最少,为219个。多态性分析结果显示,IR区域表现出最高的保守性,而高变区在SSC区;SSR位点在叶绿体基因组中分布不均,多态性较高。系统发育结果表明,宁夏枸杞和中国枸杞聚为一类,与黑果枸杞、非洲枸杞汇聚在一起形成姐妹分支,四者之间的遗传关系较近。

天南星科植物叶绿体基因组结构特征及系统发育分析:以天南星等20个物种为例

目的:天南星科植物资源丰富、分布广泛。研究天南星科植物叶绿体基因组特征,为天南星科的系统发育及进化研究提供依据。方法:本研究以GenBank数据库中获得的20条该科植物叶绿体全基因组序列为基础数据,利用REPuter、MISA、mVISTA和MAFFT等软件分析其重复序列、基因组差异、IR边界和系统发育等特征。结果:天南星科植物叶绿体基因组长度介于158521~175906 bp之间,共编码129~139个基因。在20个该科物种中,均检测出50条重复序列,正向重复和反向重复为主要类型,并鉴定出253~482个SSR位点,单核苷酸和二核苷酸重复居多。序列全局比对表明其非编码区的差异较大,并发现accD、ycf2和ycf1三个高度可变区。共线性分析可知,基因组序列同源性较高,只有一个物种发现重排或倒位现象。IR边界分析表明天南星科植物有一定保守性。所筛选的SSR位点和高度可变区可用于遗传多样性分析、物种鉴定和DNA条形码等。结论:本研究明确了天南星科物种的系统发育关系,为天南星科物种进化和遗传多样性研究提供了一定的科学依据。

珍稀濒危飘带兜兰叶绿体全基因组种内变异研究

飘带兜兰(Paphiopedilum parishii)分布范围狭窄,仅在中国、缅甸、泰国以及老挝有少量分布。近年来,因生境破坏和人为滥采而导致飘带兜兰野生种群极度缩减。为开发种内多态性的分子标记用于保护生物学研究,该研究对飘带兜兰4个野生个体经测序、组装、注释获得的叶绿体基因组序列,与已公布的飘带兜兰2个个体的叶绿体全基因组序列进行比对,分析飘带兜兰叶绿体基因组的种内差异。结果表明:(1)飘带兜兰叶绿体基因组具有典型被子植物叶绿体基因组环状四分体结构,基因组长度为154 403~154 809 bp,共编码129个基因,包括78个蛋白质编码基因、39个tRNA基因、8个rRNA基因,以及4个假基因。(2)在飘带兜兰6个个体叶绿体基因组中检测到103~107个简单重复序列(simple sequence repeats, SSRs)位点,其中21个SSR位点具有多态性。此外,在6个个体叶绿体基因组中还检测到60个长序列重复,包括17~21个正向重复、18~29个反向重复、9~16个回文重复、4~9个互补重复。(3)通过比较6个个体叶绿体基因组序列的核苷酸多样性,共发现70处变异,包括10个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNPs)、60个插入缺失(InDels)。其中,有3个SNP位点发生了非同义替换,导致编码功能基因的氨基酸发生改变;19个插入缺失多态性较高,具有开发为分子标记的潜力。(4)通过计算核苷酸多样性值(Pi)共发现8个有变异的区域,Pi值为0~0.006 32,其中变异度较大的是rps3-rpl22、trnL-UAC-rpl32、rpoB-trnC-GCA以及ycf4,这些高变区可开发为分子标记用于评估飘带兜兰遗传多样性。(5)系统发生分析结果表明,飘带兜兰6个个体叶绿体基因组序列聚在一起,与长瓣兜兰互为姐妹群。综上表明,飘带兜兰叶绿体基因组的SSRs、长序列重复、SNPs、InDels以及核苷酸序列呈现了足够的种内多样性,可开发成分子标记用于该种的系统演化及保护生物学研究。

华中樱叶绿体基因组特征与分子标记

【目的】组装华中樱叶绿体基因组并进行序列特征分析和分子标记初步鉴定。【方法】分别应用SPAdes、prodigal v2.6.3、hmmer v3.1b2及aragorn v1.2.38软件进行华中樱叶绿体基因组组装、基因编码区注释、r RNA和t RNA预测。应用OGDRAW软件进行叶绿体基因组图谱绘制。运用DNAMAN软件对26个樱亚属物种和华中樱的叶绿体基因组序列进行多重比对,人工检索华中樱特有的SNP和InDel位点。应用Codon W1.4.2和EMBOSS的cusp软件分析叶绿体基因组中基因的相对同义密码子使用度。【结果】华中樱叶绿体基因组大小为158 019 bp,其中小单拷贝区(Small single copy,SSC)、大单拷贝区(Large single copy,LSC)和反向重复区(Inverted repeat,IR)大小分别为19 247、85 910和52 862 bp,总GC含量为36.7%。华中樱叶绿体基因组共编码130个基因,包括8个核糖体RNA基因、37个转运RNA基因以及85个蛋白编码基因。序列中有SSR位点240个,其中单核苷酸重复位点153个,二核苷酸重复位点12个,三核苷酸重复位点63个,四核苷酸重复位点11个,六核苷酸重复位点1个。通过与另外26种樱亚属植物叶绿体基因组序列进行多重比对,鉴定了华中樱潜在的种特异性SNP位点29个,InDel标记8个。对密码子进行统计可知,该物种的66种密码子编码了21种氨基酸,其中RSCU> 1的密码子共有32个,有29个以A/U结尾,这些密码子结尾具有A/U偏好性。【结论】华中樱叶绿体基因组是典型的环状四分体结构,其与其他蔷薇科植物叶绿体基因组大小相近。挖掘了一批SSR、SNP和InDel标记,可为华中樱谱系地理学、群体遗传学和种间杂种鉴定等研究提供参考。

大泰竹叶绿体全基因组及系统进化分析

大泰竹(Thyrsostachys oliveri)是一种在东亚地区广泛分布的竹子,具有重要的生态和经济价值。为获取大泰竹的叶绿体分子生物学特性及明确其系统发育位置,本研究采用高通量测序技术对其叶绿体基因组进行了测序和组装,获得了完整的大泰竹叶绿体基因组序列,并对其进行基因组特征解析和系统发育分析。结果表明:(1)大泰竹的叶绿体基因组为一个典型的双环状结构,全长为139,454 bp,LSC区域的长度为82,986 bp,SSC区域的长度为12,878 bp,IR区域的长度为21,795 bp,全基因组的GC含量为38.90%,共编码了131个基因;(2)共检测到123个SSR位点,其中单核苷酸SSR最多,为102个,占总数的82.93%;(3)系统发育分析表明,大泰竹为禾本科竹亚科中的一个明确分支,与牡竹属(Dendrocalamus)的麻竹(D.latiflorus)和大叶慈(D.farinosus)亲缘关系较近。研究结果明确了大泰竹在竹类植物中的系统发育位置,同时可为竹类分类和鉴定提供新的分子依据。

白菜胞质雄性不育系叶绿体DNA的SSR分析

从烟草的36对叶绿体SSR引物中筛选出10对引物对白菜不育系和保持系的叶绿体基因组进行了SSR分析,发现两系间扩增片段的多态性较小,获得了1条只在不育系稳定出现的微卫星序列。此结果显示,不育系和保持系的叶绿体基因组间确实存在差异,此差异也许与细胞质雄性不育相关。

裂叶榆叶绿体基因组及CP-SSR位点分析

榆树材质优良,具有良好的耐旱、耐寒和耐盐碱能力,从温带、暖温带到亚热带都有分布。本研究对榆科植物(裂叶榆)的叶绿体基因组进行De novo测序,裂叶榆叶绿体基因组序列全长为158953 bp,为典型的四段式结构,其中LSC区长度为88032 bp,SSC区长18846 bp,两个IR区长26037 bp,GC含量为35. 57%。裂叶榆叶绿体基因组总共编码139个基因,包括85个蛋白编码基因、8个r RNA和46个t RNA基因。裂叶榆的叶绿体基因组存在755个SSR位点,SSR序列长度主要以6~8 bp的短序列为主,SSR共有49个重复单元,以A/T和AT/AT为主,占所有SSR位点的66. 09%。选取42个物种叶绿体基因组的共有蛋白编码基因进行系统进化分析表明,裂叶榆与大麻科、桑科物种亲缘关系最近,榆科与大麻科、桑科均属于荨麻目,与传统分类学相吻合。本研究报道了裂叶榆的叶绿体基因组序列,对今后榆树的光合作用研究、CP-SSR引物开发、进化研究及叶绿体转基因工程等研究具有重要意义。