牦牛“曲拉”干酪素凝乳酶的选择及工艺参数优化

以"曲拉"为原料,研究不同酶在凝乳酶干酪素制作中的应用效果,通过L9(34)正交试验对皱胃酶、木瓜凝乳酶、微小毛霉凝乳酶3种酶最佳工艺参数进行筛选,结合生产成本,优选出微小毛霉凝乳酶为生产凝乳酶干酪素的酶制剂,其最佳工艺条件为酶浓度3.75 mL/g,pH 7,温度55℃,CaCl2添加量12 g/kg。制品出品率73.49%,感官得分9.49,蛋白质含量85.25%,灰分7.23%,脂肪0.45%,符合QB/T3780-1999标准要求。

木瓜凝乳酶基因的克隆及序列分析

通过设计一对特异性的引物,采用RT-PCR方法从未成熟的木瓜组织中扩增得到木瓜凝乳酶基因,并将其重组到pPIC9K载体中,转化大肠杆菌并筛选阳性克隆,序列测定并利用BLAST软件进行核酸及氨基酸序列相似性分析,结果表明:通过序列组成及特征结构分析,扩增得到的基因为木瓜凝乳酶基因。

木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化及其杀伤鼠肝癌细胞的作用

目的研究木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化工艺及其对鼠肝癌细胞hepa 6的杀伤作用。方法采用羧甲基纤维素离子交换色谱分离纯化木瓜凝乳蛋白酶 ,超滤浓缩后冷冻干燥。溴化四唑蓝 (MTT)法检测酶对鼠肝癌细胞的活性。结果分离纯化得到的木瓜凝乳蛋白酶比活为 5 5 4 2 .2IU/mg ,具有显著的抑瘤作用 ,呈浓度依赖性。结论该法分离纯化的木瓜凝乳蛋白酶比活高 ,体外杀伤鼠肝癌细胞作用显著。

木瓜凝乳蛋白酶的单链单甲氧基聚乙二醇修饰产物的检测与分析

在底物保护下,采用三聚氰氯活化的单链单甲氧基聚乙二醇(mPEG1)对木瓜凝乳蛋白酶(Cp)进行了共价修饰,反应混合物经毛细管电泳(CE)分析及SephadexG75分离纯化获得修饰度为平均每分子Cp偶联3～4个mPEG1长链的修饰纯酶(mPEG1Cp).以三硝基苯磺酸(TNBS)法与CE法作对比测定了该修饰酶的平均氨基修饰度;以ELISA法检测mPEG1Cp的抗原性;用紫外吸收光谱和荧光发射光谱对mPEG1Cp进行了结构的测定分析.结果表明:Cp的mPEG1修饰产物经毛细管电泳检测为多组分体系,最大产物峰为平均每分子Cp偶联3～4个mPEG1的低修饰度修饰酶,其相对分子质量为40712～46044;该修饰酶抗原抗体结合能力完全消失,体内活性半衰期是原酶的1.6倍,同时酶活力保持在36.5%;紫外吸收光谱和荧光发射光谱分析表明:mPEG1Cp结构有轻度的改变.

木瓜凝乳蛋白酶的单甲氧基聚乙二醇化学修饰及其对酶活力和抗原性的影响

目的研究木瓜凝乳蛋白酶(Cp)的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)化学修饰对酶活力和抗原性的影响,为该酶的修饰改性提供实验依据。方法在底物保护和无底物保护下,分别以单甲氧基聚乙二醇的两种活化产物mPEG1和mPEG2对木瓜凝乳蛋白酶进行共价修饰,以三硝基苯磺酸法测定各修饰酶的平均氨基修饰度;以大分子酪蛋白和小分子BAEE为底物分别测定各修饰酶的酶活性;以ELISA法检测各修饰酶的抗原性。结果①mPEG1和mPEG2修饰均能降低及消除酶的抗原性,其中mPEG2的效果更为明显。②二者的化学修饰均使酶活力有所下降,其中mPEG1修饰酶的酶活力(分别以酪蛋白和BAEE为作用底物,下同)均高于mPEG2修饰酶的酶活力(尤其是当底物为大分子蛋白质时)。③底物保护下的修饰酶酶活力均显著高于无底物保护的酶活力。结论以mPEG1为修饰剂,在底物保护下的Cp修饰能在消除抗原性的同时,获得仍具较高酶活力的修饰酶。

木瓜凝乳蛋白酶的自水解作用及其对分离纯化的影响

对木瓜凝乳蛋白酶的自水解作用及其对分离纯化的影响作了探讨.结果表明:激活的和未激活的木瓜凝乳蛋白酶液均能发生自水解作用,而激活剂的使用可加速酶的自水解过程,在分离纯化过程中易造成分离纯化产物不均一、酶活力回收率和蛋白回收率下降等;与之相比,未激活的木瓜凝乳蛋白酶的应用可抑制或延缓分离过程中酶的水解,纯化产物蛋白回收率达64 08%,比前者提高了10%以上;酶活力回收达68 9%,比前者提高了15%.

木瓜蛋白酶中主要组分凝固大豆蛋白的特性

采用SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱分离木瓜蛋白酶得到木瓜凝乳酶和木瓜蛋白酶,测定了两种酶在不同条件下凝固大豆蛋白质过程中体系粘弹性质的变化曲线和水解进程曲线.结果表明20℃下体系形成的凝胶比40℃下形成的稳定,而且体系在低温下形成凝胶所用的酶活力比高温下所用的低;木瓜凝乳酶-SPI体系比木瓜蛋白酶-SPI体系形成凝胶所需酶活力低,且最终形成凝胶强度高,说明木瓜凝乳酶促凝SPI效果比木瓜蛋白酶好.两种酶凝固大豆蛋白的机理和作用方式存在区别.

木瓜凝乳酶基因克隆及毕赤酵母分泌型重组表达载体构建

目的扩增木瓜凝乳酶基因 ,构建重组表达载体。方法提取木瓜组织RNA ,采用RT PCR方法扩增木瓜凝乳酶基因 ,测序并利用BLAST软件进行序列分析。利用基因重组方法构建重组表达载体。结果扩增得到木瓜凝乳酶基因。结论构建了可在毕赤酵母表达系统中表达天然木瓜凝乳酶蛋白的重组表达载体。

聚乙二醇修饰对木瓜凝乳蛋白酶酶学及药物生物学性质的影响

采用活化的单甲氧基聚乙二醇（mPEG-5000）对木瓜凝乳蛋白酶（Cp）进行了共价修饰，修饰产物经毛细管电泳检测与分析表明：主产物为平均每分子Cp偶联3—4个mPEG。长链的低修饰度修饰酶．以此修饰酶为研究对象，进行了Cp在修饰前后的主要酶学、药物生物学性质的比较研究．结果表明：Cp经mPEG，修饰后，Kn^app（酪蛋白为底物）有所增加，但与Cp相比，mPEG1修饰酶的pH稳定性、热稳定性以及抗胰蛋白酶的水解能力却均有增强；药代动力学结果还显示，mPEG1-Cp的体内活性半衰期延长，修饰酶体内半衰期是原酶的1．6倍，表明mPEG1修饰酶具有更好的临床应用前景．

木瓜凝乳蛋白酶与5-Fu或MTX对人肝癌细胞7402的细胞毒试验

目的 :测定木瓜凝乳蛋白酶及其与 5 氟尿嘧啶 (5 Fu)、氨甲喋呤 (MTX )单独或联合作用对人肝癌细胞740 2的细胞毒性。方法 :采用MTT法 ,不同浓度的酶和药物在不同的培养时间下 ,通过其细胞抑制率和半数抑制率 (IC50 )测定木瓜凝乳蛋白酶及联合药物的细胞毒性。结果 :木瓜凝乳蛋白酶对 740 2细胞的IC50 约为 12 5 μg/mL ,随浓度增加对细胞的抑制率增加。培养 3 6h时酶对细胞的毒性最大。酶与 5 Fu、MTX联合使用比单独使用效果更好。结论 :木瓜凝乳蛋白酶对人肝癌细胞 740 2具有细胞毒作用 ,酶在培养 3 6h时细胞毒作用最大 ;

家兔木瓜凝乳蛋白酶抗体的制备及鉴定

木瓜凝乳蛋白酶是木瓜乳汁中的四种半胱氨酸酶之一,具有凝乳和蛋白水解特性,其最主要的用途是治疗腰椎间盘突出症。本文以部分纯化的木瓜凝乳蛋白酶为抗原,免疫家兔制备了抗体,并对抗体作了特异性鉴定,为木瓜凝乳蛋白酶的进一步研究与应用奠定了基础。

木瓜蛋白酶的开发与应用

本文总结了近年来我校木瓜蛋白酶的研究及应用进展。1)对国产木瓜乳汁粗酶进行了分离与纯化,得到了重结晶的木瓜蛋白酶和木瓜凝乳酶,结晶分别为柱状和针状;2)为了提高木瓜蛋白酶活性检测的准确性,增强国际市场的竞争能力,采用紫外分光光度法,茚三酮显色法及BAEE法对国内外不同来源的木瓜蛋白酶进行了比较,找出以上3种方法的最适反应条件、提出了在工农业生产中的应用途径;3)在研制木瓜蛋白酶的基础上,利用酶工程方法,制备了纤维素固定化木瓜蛋白酶和琼脂固定化木瓜蛋白酶,增强了酶的热稳定性及保存性,用于啤酒生产可以提高防浊效果、增进氨基酸营养;4)与广州园艺公司、广州酶制剂厂及前进食品厂等合作,进行了木瓜蛋白酶的系列产品开发,陆续研制出国产嫩肉粉、啤酒澄清剂、饼干松化剂、饲料添加剂等新产品,在食品工业和饲料工业中获得了较好的效益。

木瓜凝乳蛋白酶与平阳霉素联合使用对鼠肝癌细胞hepa-6的杀伤作用

目的 :测定木瓜凝乳蛋白酶与平阳霉素 (PYM )联合使用对鼠肝癌细胞hepa 6的细胞毒性。方法 :MTT法。结果 :木瓜凝乳蛋白酶对hepa 6细胞的IC50 约为 12 0 0 μg/ml,随浓度增加对细胞的抑制率增加。三种不同浓度的酶与PYM联合使用时细胞培养至 4 8h前 ,对鼠肝癌细胞hepa 6具有协同杀伤作用 ;这个现象与酶在生理盐水中的活力变化是一致的 ;在培养至 4 8h时第二次加入酶 ,又可以恢复PYM对鼠肝癌细胞杀伤的促进作用。结论 :木瓜凝乳蛋白酶对鼠肝癌细胞hepa 6具有细胞毒作用 ,对平阳霉素杀伤鼠肝癌细胞hepa

木瓜凝乳蛋白酶在干酪及其副产物乳清中的应用

随着干酪产业的发展,凝乳酶替代品的研究引起了人们的广泛关注。综述了凝乳酶替代品的研究现状及木瓜凝乳蛋白酶的研究进展,并展望了木瓜凝乳蛋白酶在乳品生产中的应用前景。

半胱氨酸对酶促大豆蛋白凝乳的影响

木瓜凝乳酶和木瓜蛋白酶具有促进大豆蛋白形成凝乳的作用,同时它们也是巯基蛋白酶.半胱氨酸可以激活这两种酶,而且还可以改善大豆蛋白的凝胶性.研究了半胱氨酸对酶促大豆蛋白凝胶的影响,对比了加有不同比例半胱氨酸和不加半胱氨酸体系形成凝乳过程的差异.结果表明,在木瓜凝乳酶大豆蛋白体系中,半胱氨酸对凝胶形成的辅助作用主要依靠稳定体系中的木瓜凝乳酶活力;而在木瓜蛋白酶大豆蛋白凝乳体系中,半胱氨酸不仅可以稳定体系中的酶活力,还可以和木瓜蛋白酶水解出的肽链发生作用,提高它们形成凝胶的能力.

腰椎间盘突出症盘外注射化学溶核法与疗效观察(附58例报告)

目的:探讨胶原酶治疗腰椎间盘突出症患者的临床效果。方法:腰椎间盘突出症患者58例,采用胶原酶正中和旁路椎间盘外注射法,注入地塞米松5mg、曲安舒松50mg、维生素B_(12)1mg、胶原酶1200U/5ml,术后患侧持卧位或俯卧位。结果:用腰腿痛疗效标准测定改善率,其中优良率为51.4％,有效率为86.2％。结论:胶原酶治疗腰椎间盘突出症侵入性小,化费少,疗效显著。

木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化及部分酶学性质研究

目的:从木瓜蛋白酶粗酶中分离木瓜凝乳蛋白酶,并对其部分酶学性质作初步研究。方法:采用离子交换层析分离木瓜凝乳蛋白酶,通过温度、Na+、Ca2+及其它金属离子等来研究其对酶性质的影响。结果:经离子交换得到了在PAGE中呈单一区的木瓜凝乳蛋白酶,该酶在37℃保温24h后其活力只有原来的7.5%,低浓度的Na+、Ca2+、K+、Cu2+对其有激活作用。结论:木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化及酶学性质都值得进一步研究。

番木瓜凝乳蛋白酶基因启动子的克隆及功能研究

采用PCR技术从番木瓜(Carica papaya L.)品种‘穗中红’克隆了木瓜凝乳蛋白酶基因的部分序列及其5′侧翼序列,构建含有两种长度启动子片段的植物表达载体,并用基因枪轰击番木瓜叶组织和农杆菌转化烟草叶盘。结果表明,克隆产物长719bp,163bp的3′侧翼序列与GenBank中的番木瓜凝乳蛋白酶基因序列同源性为99%,556bp的5′侧翼序列有基础启动子区,转录起始位点位于ATG上游38bp的T。序列登录号为AY803756。预测在启动子区存在TATA-box、CAAT-box、WUN和HSE等顺式作用元件。两种启动子片段驱动的GUS基因瞬时表达和稳定表达结果表明,该启动子片段具有乳管特异表达活性。

软质干酪的酶凝乳工艺研究

为了探求软质干酪的最佳酶凝乳工艺,采用L9(34)和L16(45)正交试验,研究了皱胃酶、木瓜酶、米黑毛霉酶三种单酶的最佳工艺以及复配酶最佳工艺,确定了皱胃酶添加量0.0125%,凝乳温度32℃,时间45 min;木瓜酶添加量0.01%,凝乳温度33℃,时间35min;米黑毛霉酶添加量0.0035%,凝乳温度32℃,时间40 min;复配酶最佳工艺参数为皱胃酶用量0.004%,木瓜酶用量0.006%,米黑毛霉酶用量0.0023%,温度32℃,凝乳时间30 min。结果表明,单酶复配具有协同作用,能够有效优化干酪酶凝乳工艺。

木瓜凝乳蛋白酶研究进展

概述了木瓜凝乳蛋白酶 (EC3.4 .2 2 .6 )在结构、性质。