氯霉素间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法的建立

以人工合成的氯霉素 -牛血清白蛋白 (CAP- BSA)为包被抗原 ,氯霉素 (CAP)为竞争半抗原 ,两者与一定量的抗CAP- Mc Ab反应。结果表明 ,理想的包被抗原质量浓度为 1.2 5 mg/ L ,抗 CAP- Mc Ab稀释倍数为 1∶ 12 0 0 0 ,酶标二抗稀释倍数为 1∶ 5 0 0 0 ,最适检测范围为 1～ 10 0 μg/ L,最小检测量为 0 .1μg/ L,批内和批间变异系数分别为 3.6 2 %和 5 .19%。得到回归方程 (y =1.2 730 - 0 .6 74 5 x,r2 =0 .9779)和标准曲线 ,从而建立了快速定量测定 CAP含量的间接竞争酶联免疫吸附试验 (ci EL ISA)。

恩诺沙星单克隆抗体的制备及ciELISA试剂盒的研制

【目的】研制快速、灵敏、特异的恩诺沙星残留检测ciELISA试剂盒（ENR—Kit），为动物源性食品中恩诺沙星（ENR）残留的快速免疫学检测奠定基础。【方法】通过细胞融合技术制备恩诺沙星单克隆抗体（ENRmAb）杂交瘤细胞株，体内诱生腹水法生产ENR单抗，应用ENRmAb研制ENR残留间接竞争ELISA（ciELIsA）快速检测试剂盒，并对其灵敏度、半数抑制浓度（IC50）、特异性、准确度和基质效应性进行检测。【结果】筛选出2株杂交瘤细胞，其单抗亚类均为IgG1亚型。4G1-B3杂交瘤细胞株的ENRmAb间接ELISA效价为1：1.024×10^5，亲和常数（Ka）为9×10^10L／moL。ENR—Kit的线性检测范围为0．05～48．75μg／L，灵敏度0．05μg／L，半数抑制浓度（IC50）为1．31μg／L，与环丙沙星的交叉反应率（CR）为0．02％，与其他化合物的交叉反应率（CR）均〈0．01％。ENR-Kit对牛奶样、鱼肉样和鸡肉样中ENR的平均添加回收率分别为96．49％，86．95％和84．13％，平均变异系数均〈10％，不同基质对ENR—Kit检测结果影响小。【结论】研制的ENR—Kit具有快速、敏感、特异、简便等特点，适合ENR残留快速检测的推广应用。

氯霉素间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法的建立

以人工合成的氯霉素－牛血清白蛋白（ＣＡＰ－ＢＳＡ）为包被抗原，氯霉素（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ，ＣＡＰ）为竞争的半抗原，两者与一定量的抗ＣＡＰ单抗（ＣＡＰ－ＭｃＡｂ）反应。实验结果表明，理想的包被抗原浓度为１．２５μｇ／ｍｌ，抗ＣＡＰ－ＭｃＡｂ工作浓度为１：１２０００，酶标二抗工作浓度为 １： ５０００，可测最适范围为 １ｎｇ／ｍｌ－１００ｎｇ／ｍｌ，最小检测量为０．１ｎｇ／ｍｌ，批内和批间变异系数分别为３． ６２％和 ５． １９％。得到回归方程 ｙ ＝１．２７３０－ ０．６７４５ｘ（ｒ２＝ ０． ９７７９）和标准曲线，从而建立了快速定量测定 ＣＡＰ含量的间接竞争酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）。整个测定时间为６小时。

呋喃唑酮间接竞争ELISA(ciELISA)检测法的建立

为快速检测水产品中FZ残留ELISA ;将呋喃唑酮 (Furazolidone ,FZ)与牛血清白蛋白 (BSA)、人血清白蛋白 (HSA)联接 ,分别作为免疫原及包被原 ,建立了水产养殖动物组织中呋喃唑酮的ELISA筛选方法。实验结果表明 ,理想的呋喃唑酮———人血清白蛋白 (FZ- HSA )包被抗原的浓度为 1.2 5 μg/mL ,酶标二抗 (羊抗兔IgG HRP)的工作浓度为 1∶10 0 0 ,多抗 (FZ- PcAb)的工作浓度为 1∶3 2 0 0 ,可测定的最适范围为 10～ 10 0ng/mL ,最小检测限为 1ng/mL。本实验所建立的ELISA方法的孔间差异为 4.16% ,板间差异为 9.2 0 % ,实验重复性好。添加回收率试验测的虾肉样本品均回收率为 (94.86± 9.5 5 ) %。在实验浓度范围内 ,呋喃唑酮 (FZ)的抗血清与氯霉素 (Chloramphenicol)、磺胺二甲基嘧啶 (Sulfamethazine)、红霉素 (Erythromycin)、恩诺沙星 (Enrofloxacin)、甲氧苄啶 (Trimethoprim )等可能会因同时使用而导致共同残留的抗微生物药物未显示免疫交叉反应性 ,与结构相似或相近药物呋喃西林 (Furacilinum)的交叉反应性为 43 %。这表明所建立的方法有较高特异性和灵敏度 ,适合呋喃唑酮残留的快速筛选。整个测定时间为 5h。

强力霉素单克隆抗体制备及ciELISA检测方法的建立

以人工合成的强力霉素-牛血清白蛋白(DC-BSA)为抗原免疫BALB/C小鼠,用间接ELISA和间接竞争ELISA法选择细胞融合的备用小鼠;应用杂交瘤技术建立分泌DC McAb的杂交瘤细胞株,用体内诱生法制备DC McAb,并对DC McAb的免疫学特性进行鉴定;应用DC McAb建立检测DC的ciELISA方法,并对其相关特性进行检测。结果表明:筛选后获得1株分泌特异性抗体的细胞3D1-H4,细胞培养上清效价为1∶(8×102),腹水效价为1∶(5.12×105),抗体为IgG1型免疫球蛋白,与四环素、土霉素和金霉素分别有8.87%、5.86%和2.74%的交叉反应率,与其他抑制物无交叉反应性;ciELISA检测方法的线性范围为1.58～199.53 ng/mL,灵敏度为2.88 ng/mL,半数抑制的质量浓度IC50为36.31 ng/mL,斑点叉尾鮰肌肉和肝脏样品中DC的平均添加回收率分别为85.13%和79.69%,平均批间和批内变异系数均小于15%,不同基质对检测结果影响小。所建立的ciELISA方法可以应用于水产品中DC残留的检测。

利用SD大鼠抗血清建立瘦肉精ciELISA检测方法的研究

以克伦特罗（CL）为竞争半抗原,人工合成的克伦特罗-卵清白蛋白（CL-OVA）为包被抗原,两者与一定量的SD大鼠抗CL血清反应,建立快速定量测定CL含量的间接竞争酶联免疫吸附检测（ciELISA）方法.结果表明,理想的包被抗原质量浓度为3μg/mL,抗CL血清稀释倍数为1∶1.6×10^5.绘制出标准曲线,线性检测范围为4.88～5 000ng/mL,线性回归方程为y=-0.295 2x＋1.160 6,r^2=0.990 2,加标平均回收率为95.45%.该方法敏感性高,特异性强,操作简便,对于研制瘦肉精残留检测试剂盒有重要意义.

抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及ciELISA试剂盒的研制

将氯霉素（CAP）化学修饰引入羧基活性基团，形成具有半抗原结构特征的氯霉素半琥珀酸酯（CAP—HS），用混合酸酐法制备免疫原BSA-CAP—HS和包被原OVA—CAP—HS，用UV，SDS—PAGE进行鉴定；BSA—CAP—HS免疫BALB／C小鼠，细胞融合技术筛选抗氯霉素单克隆抗体（CAPmAb）杂交瘤细胞株，体内诱生腹水法制备CAPmAb，并鉴定其免疫学特性；应用CAPmAb研制CAP残留快速检测ciELISA试剂盒（CAP—Kit），并测定其性能．结果表明，BSA—CAP—HS偶联成功，分子结合比为1：15．6；筛选出3株杂交瘤，其中最好的4F0株间接ELISA效价细胞上清为1：1．28×10^3，腹水为156．4×10^5，亲和常数（Ka）为1．84×10^10L·mol^-1，半数抑制浓度（IC50）为2．4μg·L^-1，与氯霉素琥珀酸钠的交叉反应（CR）为150％，与其它酰胺醇类和抗菌素药物无交叉反应；CAP—Kit的标准曲线呈典型的S型，符合4参数logit曲线拟合，线性范围为0．1～128μg·L^-1，灵敏度为0．053μg·L^-1检测限为0．1μg·L^-1，奶样、肉样的平均添加回收率为88．5％，82．7％，平均批内和批间变异系数〈15％．CAP—Kit在4oC可保存180d．

α-玉米赤霉烯醇单克隆抗体的研制及CiELISA检测方法的建立

为了建立快速、简便、灵敏的检测动物性食品中α-玉米赤霉烯醇(α-Zearalenol,α-ZOL)残留的方法,试验利用活性酯法将α-ZOL与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶联鉴定后常规免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠。经筛选,获得1株稳定分泌抗α-ZOL单克隆抗体的杂交瘤细胞(1D4),利用1D4获得的抗α-ZOL单克隆抗体建立了检测α-ZOL的间接竞争酶联免疫吸附试验(Ci ELISA)方法。结果表明:该检测方法在1~1 000 ng/m L范围内线性良好,标准曲线方程为y=0.280 2x+0.025 6(R2=0.990 1),半数抑制浓度为76.32 ng/m L。牛奶加标回收试验显示,α-ZOL的回收率在81.29%~117.53%之间,变异系数在4.42%~9.33%之间。试验建立的Ci ELISA检测方法可用于牛奶中α-ZOL残留的定量检测。

19-去甲睾酮异源性ciELISA试剂盒的研制及应用

筛选抗19-去甲睾酮(NT)单克隆抗体,建立异源性ciELISA试剂盒。用人工抗原NT-17-BSA免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立1株抗NT单克隆杂交瘤细胞NT1-B7,同种型为IgG1/k,腹水效价达0.64×105,亲和常数(Ka)为4.31×109L/mol,半数抑制浓度(IC50)为0.55ng/ml,与群勃龙和雌二醇的交叉反应率(CR)分别为2.2%和1.6%,与其它化合物无CR。异源性ciELISA试剂盒在猪肉、猪尿、牛肉和牛尿四种基质中的检测限分别为0.24ng/ml、0.23ng/ml、0.22ng/ml和0.17ng/ml,批内和批间相对标准差(RSD)在4.4%～21.8%,添加回收率在85%～110%,4℃下保存期至少6个月。NT-Kit的基质pH适用范围为6.5～7.5,温育过程优化后可节约检测时间30～90min。试剂盒灵敏度高、特异性强,可应用于样品基质中NT残留检测。

抗氯霉素单克隆抗体的制备及鉴定

用人工合成的氯霉素－人血清白蛋白（ＣＡＰ－ＨＳＡ）免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过杂交瘤技术建立了一株分泌抗ＣＡＰ单克隆抗体（ ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞 １Ｆ９。经检测，其分泌的抗体亚类为 ＩｇＧ１； 杂交瘤染色体数目 ８４－ ９６ 条；间接 ＥＬＩＳＡ检测细胞培养上清效价为１：２５６，诱生腹水抗体效价可达１：６×１０５；该细胞连续培养生物学性状稳定，竞争间接酶联免疫吸附试验（ｃｉＥＬＩＳＡ）显示与供试抗生素交叉反应小。该单抗有较大的应用价值。

氟喹诺酮类药物多组份残留的酶免疫分析法

采用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯法制备诺氟沙星、环丙沙星、达氟沙星和沙拉沙星完全抗原,经紫外光谱扫描鉴定后,免疫小鼠,ELISA测定抗体交叉反应性,筛选簇特异性抗体,建立多组份ciELISA检测方法。紫外光谱扫描结果证实4种半抗原与载体蛋白发生共价结合,所制备的沙拉沙星与诺氟沙星抗血清效价都在1∶64000以上,环丙沙星和达氟沙星抗血清效价都在1∶32000以上。交叉反应率测定结果表明,沙拉沙星抗血清对沙拉沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的交叉反应率依次为100.00%、92.68%、89.12%和83.56%;利用沙拉沙星抗血清建立了针对上述4种药物的多组份ciELISA检测方法,最低检测限依次为19.3、34.5、31.3、29.2μg/L,大于5μg/L水平的添加回收率均大于83%。

表皮生长因子酶联免疫吸附检测方法的建立

目的 建立酶联免疫吸附法 ( ELISA)检测人血清 (浆 )或尿液中表皮生长因子的含量。方法 以rh EGF为包被抗原 ,表皮生长因子 ( epidermal growth factor,EGF)为竞争的抗原 ,两者与一定量的抗EGF多抗反应。以抑制率为纵坐标 ,EGF的对数值为横坐标建立标准曲线。结果 实验结果表明 ,理想的包被抗原浓度为 1μg/ml,抗 EGF多抗工作浓度为 1∶ 1 0 0 0 0 0 ,酶标二抗工作浓度为 1∶ 30 0 0 ,可测量最适范围为 0 .2 5～ 32 ng/ml,最小检测量为 0 .5 ng/ml,批内和批间变异系数分别为 3.48%和 5 .46%。得到回归方程 Y=- 0 .1 2 81 Ln( X) + 0 .81 1 6( r2 =0 .9938)和标准曲线。结论 建立快速定量测定

水产品中磺胺二甲嘧啶间接竞争ELISA检测法的建立

将磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine,SM2)与牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)偶联,分别作为免疫原及包被原,建立了水产品中磺胺二甲嘧啶间接竞争ELISA检测方法。实验结果表明,理想的磺胺二甲嘧啶人血清白蛋白(SM2HSA)包被抗原浓度为1mg/L,酶标二抗(羊抗兔IgG HRP)工作浓度为1/1000,多抗(SM2PcAb)工作浓度为1/3200,最适检测范围为10～200μg/L,最低检测限为1.89μg/L,本实验所建立间接竞争ELISA检测方法的孔间差异为2.56%,板间差异为5.14%,实验重复性好。在实验浓度范围内,磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine)的抗血清与磺胺嘧啶(Sulfadiazine)、磺胺甲唑(Sulfamethoxazole)、氯霉素(Chloramphenicol)、恩诺沙星(Enrofloxa cin)、甲氧苄啶(Trimethoprim)、呋喃唑酮(Furazolidone)等可能会因同时使用而导致共同残留的抗菌药物未显示免疫交叉反应性,与结构相近的磺胺类药物磺胺嘧啶的交叉反应性为11.0%。所建立的方法有较高特异性和灵敏度,适合磺胺二甲嘧啶的快速筛选。整个测定时间为5～6h。

葡萄球菌A型肠毒素检测竞争ELISA方法的建立

为建立快速、灵敏、特异的检测食品中金黄色葡萄球菌A型肠毒素的方法,应用构建的pGEX-6P-SEA、pET28α-SEA重组质粒表达带有不同融合肽的葡萄球菌A型肠毒素,分别通过谷胱甘肽亲和纯化、镍螯合纯化获得SEA的重组融合表达蛋白HIS-SEA、GST-SEA,以HIS-SEA为包被抗原,以GST-SEA、天然SEA肠毒素为竞争抗原,确立了SEA型肠毒素ELISA检测的工作条件:包被浓度为2.5μg/mL,阳性血清稀释度为1∶50,辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡免疫球蛋白工作浓度为1∶2000。建立了以重组肠毒素GST-SEA作为竞争抗原检测葡萄球菌肠毒素SEA的间接竞争ELISA(ciELISA)方法,竞争肠毒素GST-SEA蛋白浓度x与P/N值y的关系式:x(GST-SEA)=1.99-y/0.34,R2(GST-SEA)=0.9964,线性检测范围均为1～62.5ng/mL,最低检测量为1ng/mL,此方法丰富了食品中A型肠毒素的检测手段。

氯霉素单克隆抗体ELISA检测方法的建立

目的建立CAP间接和直接ELISA检测方法。方法用重氮化法分别偶联氯霉素(Chloramphenicol,CAP)与BSA和OVA作为免疫原和检测原,腹腔注射8周健康雌BALB/c小鼠大量制备抗CAP的单克隆抗体并优化条件,建立了CAP的快速、灵敏、简便的直接和间接竞争ELISA方法。结果两种检测方法的回归方程和相关系数分别为:y=-25.411x+97.041,R2=0.9889和y=-27.768x+103.91,R2=0.9889,线性范围分别为1.87-75 ng/mL和0.93-25ng/mL,对CAP的最低检出浓度为0.97 ng/mL和0.35 ng/mL。并利用所建立的两种ELISA方法对鸡肉模拟样品进行了检测,其检测样品的回收率分别为98.607%,85.152%。结论为下步CAP的试纸条或试剂盒建立提供基础。

抗微囊藻毒素单克隆抗体的制备与鉴定

构建了微囊藻毒素(Microcystin-LR,MC-LR)完全免疫原MCLR-KLH,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗MCLR单克隆抗体,用间接竞争ELISA方法筛选抗体。经过3次克隆,获得2株可稳定分泌抗MCLR单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水效价达1:8?104;IC50为0.81 ng?m L?1,最低检测限0.10 ng?m L?1,亲和常数3.8?108 L?mol?1,电泳结果显示抗体由1条重链和1条轻链组成,与MC-LR同系物MC-RR、MC-YR有较强的交叉反应,与MC-LW有弱交叉性反应,与河豚毒素无交叉反应。实验结果表明该抗体质量较好,将在微囊藻毒素的快速检测、产生机理等方面具有较大的科研和应用价值。

牛奶及奶粉中三聚氰胺残留酶联免疫检测方法的研究

通过4,6-二氨基-2-氯-1,3,5-三嗪与对氨基苯丁酸反应获得三聚氰胺半抗原,再以活性酯法与载体蛋白偶联制备三聚氰胺免疫原或包被原。免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备出针对三聚氰胺的特异性单克隆抗体。采用间接竞争酶联免疫吸附法(ciELISA)建立检测三聚氰胺的标准曲线,线性范围是17.4～345.5ng/mL,50%抑制浓度(IC50)61.3ng/mL。牛奶和奶粉加标回收率在68.1%～91.0%,变异系数在2.4%～14.5%。结果表明,该方法可以满足牛奶和奶粉中三聚氰胺残留分析要求。

抗氯霉素单克隆抗体的制备及鉴定

用人工合成的氯霉素 -人血清白蛋白 (CAP- HSA)作抗原免疫 BAL B/ c小鼠 ,通过杂交瘤技术建立了 1株分泌抗CAP单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞 1F9。经检测 ,其分泌的抗体亚类为 Ig G1 ,杂交瘤染色体数目 84～ 96条 ,间接EL ISA检测细胞培养上清效价为 1∶ 2 5 6 ,诱生小鼠腹水的抗体效价可达 1∶ 6× 10 5。该细胞连续培养生物学性状稳定 ,竞争间接酶联免疫吸附试验 (ci EL ISA)显示 ,其与供试抗生素交叉反应小 。

孔雀石绿单克隆抗体的制备及其鉴定

用人工合成的无色孔雀石绿-兔血清白蛋白(LMG-RSA)作抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术筛选抗无色孔雀石绿的单抗,单抗经纯化后对其特异性和灵敏性进行了鉴定,探讨了建立孔雀石绿的免疫学检测方法。结果显示,经细胞融合和筛选得到了1株分泌抗无色孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞5E9。经鉴定,该杂交瘤细胞的染色体数为98.82±5.6,间接ELISA检测小鼠腹水的抗体效价达1.3×105,该细胞连续培养10代以上,生物学性状稳定,间接竞争ELISA(ciELISA)结果显示,无色孔雀石绿50%抑制的质量浓度为18.5μg/L,除孔雀石绿外,与其他类似结构和相关类型的药物没有交叉反应,表明该单抗用于孔雀石绿的检测有较大的应用价值。

恩诺沙星多克隆抗体制备及阻断ELISA检测方法的研究

采用混合酸酐法将恩诺沙星（ENR）分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联制备免疫抗原（ENR—BSA）和包被抗原（ENR—OVA）．将免疫原免疫家兔，制备多克隆抗体（ENRpAb），应用ENRpAb研制ENR残留阻断ELISA快速检测方法，并对其灵敏度、半数抑制浓度IC50、特异性、准确度进行测定．结果阻断ELISA的线性检测范围为1～205ng／mL，灵敏度1ng／mL，半数抑制浓度（IC50）为11ng／mL，与其他化合物的交叉反应率（CR％）均〈0．1％，鸡肉样的平均添加回收率分别为87．35％，平均变异系数均〈10％．本检测方法具有快速、敏感、特异、简便等特点，适合ENR残留快速检测的推广应用．