EGFP-CIDE-3及D sRed1-CIDE-3融合基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达和定位

目的:分别构建EGFP、DsRed1与CIDE-3的融合基因真核表达载体,观察其在人胚肾上皮细胞293T中的表达,确定CIDE-3的亚细胞定位。方法:分别以质粒pEGFP-C3、pDsRed1-N1及本实验室克隆得到的质粒pET28a(+)-CIDE-3为模板,PCR扩增EGFP、DsRed1 DNA片段及人CIDE-3基因的CDS序列,再分别将EGFP、CIDE-3及DsRed1、CIDE-3克隆入真核表达载体pShuttle-CMV中。酶切、测序鉴定后,经磷酸钙转染入293T细胞,通过荧光显微镜观察其在293T细胞中的表达,并利用荧光染料Bodipy 493/503定位脂滴,探讨CIDE-3与脂滴之间的关系。结果:酶切及DNA测序证实,重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShuttle-CMV-DsRed1-CIDE-3构建成功。荧光显微镜观察显示,pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3融合蛋白定位于细胞质,pShuttle-CMV-DsRed1-CIDE-3融合蛋白也定位于细胞质,并与脂滴存在共定位关系。结论:成功构建了重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShuttle-CMV-DsRed1-CIDE-3;两者均可在239T细胞中表达,融合蛋白分布于细胞质,并与脂滴存在共定位关系。

酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-cide-3的构建、鉴定以及毒性、自激活效应的检测

目的:构建并转化酵母双杂交体系中"诱饵"载体pGBKT7-cide-3以便用于人肝cDNA文库的筛选。方法:用RT-PCR方法从人肝细胞株QZG中扩增cide-3基因全外显子片段,并定向克隆入细菌-酵母穿梭表达质粒pGBKT7中;用PEG/LiAC法将pGBKT7-cide-3转化感受态酵母菌AH109。提取转化酵母菌的质粒DNA和总蛋白进行鉴定。同时检测表达产物对报告基因的激活作用及对酵母株AH109的毒性。结果:成功扩增出人cide-3 cDNA片段,限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒pGBKT7-cide-3;获得可在色氨酸缺陷培养基(SD/-Trp)上生长含pGBKT7-cide-3的酵母菌克隆。鉴定表明pG-BKT7-cide-3已转化入酵母菌AH109,无自主激活报告基因的能力及对酵母的生长无毒性。结论:酵母双杂交"诱饵"载体pGBKT7-cide-3构建获得成功,可应用于酵母双杂交体系。

人CIDE-3蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:制备人诱导细胞死亡的DFF45样效应因子-3(CIDE-3)蛋白兔抗人多克隆抗体并进行鉴定。方法:将原核表达载体pET28a(+)/CIDE-3转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达CIDE-3蛋白,经Ni-NTA Agarose纯化后免疫新西兰白兔,获得人CIDE-3蛋白兔抗血清,并通过免疫印迹(Western blot)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及免疫组织化学法对抗体进行鉴定。结果:成功地表达、纯化了人CIDE-3蛋白,与弗氏佐剂乳化后,免疫新西兰白兔,获得高效价的人CIDE-3蛋白兔抗血清,ELISA结果证实该抗体具有较高的亲和性,Western blot及免疫组织化学染色显示证实该抗体能够与人CIDE-3蛋白特异性结合,是一种细胞质蛋白。结论:获得了效价高、特异性较强的人CIDE-3蛋白兔抗血清,为进一步研究人CIDE-3奠定了实验基础。