班皮桉及其近邻树种CCR基因分子变异分析

选取伞房属班皮桉及其近邻树种共5部类16个样本提取基因组DNA,用2对引物进行PCR扩增,采用凝胶直接纯化,改进测序反应后测序.以Eucalyptus gunniiCCR作对照,通过ClustalW进行比对分析序列变异和MEGA 3进行系统进化分析.结果显示:在所得到的伞房属16个样本CCR序列中,A,C,G和T 4种核苷酸所占比例分别为24.92%,23.18%,23.22%和28.67%,A+T含量明显高于G+C.共发现292个变异位点,占分析位点总数的9.71%,变异除118个转换和97个颠换外,有93个位点的插入/缺失,其中简约信息位点185个,占63.36%.部分变异位点重叠.转换与颠换比值为1.22∶1.00.CCR系统发育树显示:E.gunnii是一个单独分枝,5部类亲缘可以分辨开来,Rufaria尤其明显.Rufaria最早产生分歧,其次是Ochraria和Cadagaria,Blakearia分歧属最迟进化.

伞房属CCR基因PCR优化体系建立及多拷贝的发现和分析

对伞房属CCR基因进行扩增,对影响PCR的条件进行优化,结果筛选出引物对A-3198适宜的PCR循环条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火lmin,72℃延伸2min,运行30个循环;最后72℃后延伸7min。对伞房属树种进行PCR扩增时,发现用同一引物对,一个样本可以扩增出不同长度的条带。将目的片段进行克隆测序,得到6个序列。所分析的基因片段从Exon3-Exon5,其中Exon3变异位点具有3个,Intron3无变异位点;Exon4变异位点具有7个,Intron4变异位点最多,达到276个,Exon5变异位点也只有6个。从变异位点所占百分数分析,所有外显子包括Exon3、Exon4和Exon5,变异数百分率很低,从1.67%-1.98%,说明外显子是相对保守和稳定的。Intron3最稳定,无任何差异位点。Intron4差异最大,差异百分数高达,19.99%。在Intron4有4处插入发生。第1处插入发生在第2041-2067,插入27个碱基。第2处插入发生在第2127-2289,插入163个碱基。第3处插入为PolyA,6个样本都存在PolyA。第4处为SSR序列。在外显子上未发现2个或2个以上碱基的插入/缺失。从氨基酸的变异来分析,所发生的核苷酸变异很多是无义突变,只有Exon3的2个氨基酸、Exon4的3个氨基酸,以及Exon5的2个氨基酸发生有义突变。本试验于国内外首次发现伞房属树种CCR基因具有多拷贝现象,而在桉树另外2个属桉属和杯果木属的CCR研究中未曾发现。