Establishment of a Real-time Fluorescent Quantitative RTPCR Method for Detecting NP Gene of Class Ⅰ Newcastle Disease Virus(NDV)

Newcastle disease( ND) is one of the most serious infectious diseases that infect the poultry industry.There is only one serotype of Newcastle disease virus( NDV),but NDVs can be divided into two distinct classes( class Ⅰ,and class Ⅱ) according to their genetic relationship.To develop a method for rapid quantitative detection of class Ⅰ NDV,a pair of primers and a TaqM an probe were designed and synthesized according to the conservative sequence of NP gene of class Ⅰ NDV.The positive recombinant plasmid harboring NP gene of JS-18-05 isolate was used as a positive template to establish the standard curve.A real-time fluorescent quantitative RT-PCR method was established for rapid detection of class Ⅰ NDV with strong specificity,high sensitivity and good repeatability.The established method exhibited a good linear relationship within the concentration of 102 to 108 copies of NDV,by which 1 μl of 10 copy of NDV nucleic acid could be detected in the initial template.Compared with conventional virus isolation methods,the established method had similar sensitivity and led to the same results in detecting33 class Ⅰ,class Ⅱ NDV isolates.The study provided the basis for rapid quantitative detection of class Ⅰ NDVs and further clarification of their pathogenicity and pathogenic mechanism in poultry.

ClassⅠ新城疫病毒NP基因分子特征的研究

为分析2002～2007年Class Ⅰ新城疫病毒分离株NP基因的分子特征,以及其在新城疫病毒演化过程中所起的作用,采用RT-PCR方法扩增分离株的核衣壳蛋白(NP)基因,并进行了测序,应用生物信息学软件分析NDVNP基因的分子特征。根据NP基因序列的遗传发生分析表明,ClassⅠ NDV2型毒株与DE/R49-99和美国株亲缘关系较近,而3型毒株与其他ClassⅠ毒株遗传关系较远,具有地区特色,形成一个独立的分支。生物信息学软件分析表明,NP蛋白N端1～400氨基酸比较保守,而C端序列(特别是氨基酸残基400～480)高度变异。ClassⅠ病毒2型毒株与国外分离株亲缘关系较近,可能有共同的起源;而3型毒株独立于其他ClassⅠ毒株,具有独特性,这两种毒株的来源不同;不同基因型NP蛋白之间比较保守,但是P蛋白的C端发生了多个氨基酸的变异,对其功能的影响还需进一步探讨。

马铃薯class Ⅰ patatin基因在试管块茎形成中的功能

将正反义classⅠpatatin基因导入马铃薯品种甘农薯2号中,有2个转正义基因株系试管块茎的可溶性蛋白含量和LAH活性与对照相比有不同程度的增加,有3个转反义基因株系的可溶性蛋白质含量下降,并且所有转反义基因植株的LAH活性都不同程度地降低。试管块茎的诱导结果表明,有1个转正义基因株系的结薯株率和单株结薯数比其对照明显增加,有2个转反义基因株系的结薯株率和单株结薯数比对照明显减少,说明该classⅠpatatin基因参与了马铃薯试管块茎的形成及其调控。

KNOX Ⅰ类基因在雌蕊发育中的作用

雌蕊由心皮和花柱组成并最终发育成果实,其发育对作物的产量、质量都有决定性的影响。因此,对雌蕊败育相关基因的研究是植物生物学研究领域的热点,KNOX家族是植物中的5个同源异型盒基因家族之一,分为Ⅰ类和Ⅱ类KNOX亚家族,主要在植物茎顶端分生组织中特异表达,是分生组织发生与维持所必需的关键基因,调控与器官发生相关的细胞分化,最终影响侧生器官的形态建成、该文综述了与雌蕊发育相关的KNOX家族基因功能,重点对KNOX家族中的KNOX Ⅰ类基因进行了阐述。

马铃薯classⅠpatatin基因家族的一个新亚型

马铃薯class Ⅰ与classⅡ patatin基因是具有不同组织表达专一性的一个多基因家族。用马铃薯classⅡ patatin启动子为探针,从中国马铃薯(Solanum tuberosum)栽培品种“东农303”基因文库中筛选到一个classⅠpatatin基因。测定其DNA顺序1.8kb;它包括patatin基因5′侧翼区1407bD、结构基因363bp。根据5′端非翻译区顺序,它属classⅠpatatin基因。该基因的5′侧翼区同已报道6种classⅠpatatin基因亚型5′侧翼区之间存在较大片段的缺失与插入,它可能是一新的classⅠpatatin亚型。

朝鲜鹌鹑MHC class Ⅰ基因第2、3外显子多态性与NDV抗性的关联分析

【目的】研究朝鲜鹌鹑MHC classⅠ基因第1,2和3外显子的多态性,并与新城疫病毒抗性进行关联分析。【方法】采用胸肌注射的方法对14日龄朝鲜鹌鹑进行新城疫La Sota弱毒株攻毒,每周注射1次,连续攻毒3周后,心脏采血,采用β-微量法测定血清中新城疫抗体水平。PCR扩增朝鲜鹌鹑MHC classⅠ基因,测序后采用DNA Star、SPSS等分析软件研究朝鲜鹌鹑MHC classⅠ基因第1,2,3外显子的多态性,并分析不同基因型新城疫抗体水平的差异。【结果】朝鲜鹌鹑的新城疫抗体效价为26～210。PCR扩增获得了1 290bp的MHC classⅠ基因,其编码区序列为780bp,编码259个氨基酸。通过与已知序列日本鹌鹑RNA(AB005528)比对,得到长度分别为76,272和274bp的第1,2和3外显子。在第1外显子上未检测到突变为点,在第2和3外显子上共检测到11个突变位点(第2外显子上4个突变位点:257bp(A/C)、267bp(A/T)、366bp(A/G)和500bp(T/G);第3外显子上7个突变位点:795bp(T/C)、798bp(T/C)、810bp(T/G)、830bp(A/G)、873bp(A/T)、927bp(A/G)和932bp(C/G)),均为中度多态基因座,11个突变位点中,267bp(A/T)、830bp(A/G)、873bp(A/T)、932bp(C/G)突变导致编码氨基酸改变,500bp(T/G)、873bp(A/T)、932bp(C/G)突变位点基因型之间新城疫抗体水平存在显著差异(P<0.05)。【结论】朝鲜鹌鹑MHC classⅠ基因第2、3外显子具有丰富的多态性,并且与新城疫病毒抗性相关。

390株肠球菌耐药性及Ⅰ类整合子的检测

目的调查390株肠球菌耐药性及Ⅰ类整合子的携带率,以利于临床治疗用药。方法根据NCCLS推荐的琼脂稀释法进行药敏试验,应用WHONET5软件进行统计分析;采用PCR方法进行Ⅰ类整合子的检测以及滤膜接合法进行质粒接合转移试验;联合药敏试验采用棋盘法。结果粪肠球菌对氨苄西林、青霉素、氯霉素、左氧氟沙星MIC50和MIC90分别为4、16μg/ml;8、16μg/ml;16、64μg/ml;4、16μg/ml;屎肠球菌对上述4种抗菌药物的MIC50和MIC90分别为64、128μg/ml;64、128μg/ml;32、128μg/ml;32、128μg/ml;粪肠球菌和屎肠球菌对万古霉素MIC50和MIC90均分别为2μg/ml和4μg/ml;324株粪肠球菌和66株屎肠球菌Ⅰ类整合子的携带率分别为53.1%和51.5%;Ⅰ类整合子携带aadA2基因;40株粪肠球菌和20株屎肠球菌中的Ⅰ类整合子全部转移到受体菌中;对链霉素MIC≤2 000μg/ml的菌株,链霉素与氨苄西林的FIC指数≤0.5。结论屎肠球菌对青霉素、氨苄西林、氯霉素、左氧氟沙星等抗菌药物的MIC50和MIC90显著高于粪肠球菌;万古霉素对粪肠球菌及屎肠球菌具有很好的抗菌作用;由质粒携带的整合子可通过质粒播散耐药性;携带Ⅰ类整合子及aadA2基因且非高耐链霉素的肠球菌,链霉素与氨苄西林具有协同抗菌作用。

五指山小型猪近交系白细胞抗原Ⅰ类3基因的研究

【目的】为探讨五指山小型猪(WZSP)近交系群体中SLAⅠ3(SLA-3)位点等位基因分布结构及其特性。【方法】利用4对引物,采用RT-PCR扩增了32头WZSPSLA-3基因部分外显子1、外显子2和大部分外显子3序列。根据家系和扩增结果,选择8头个体的PCR产物克隆测序。【结果】获得9个不同的核苷酸序列。与GenBank中所用SLA-3基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行比较分析,确定这9个序列均为SLA-3位点上的新等位基因,但这些等位基因间核苷酸变异很少;氨基酸序列比较发现猪和人之间有很高的保守性。同时,构建了23个SLA-3的等位基因和1个HLA-A等位基因核苷酸序列的系统树。【结论】WZSP在SLA-3位点和其它猪品种有明显的差异,拥有其独特的遗传资源。从分子水平为WZSPSLA-3基因的分子分型及特异单倍体猪的培育和异种器官移植实验用动物的研究提供理论依据。

MHC-Ⅰ类链相关基因A真核表达载体的构建及稳定转染舌鳞癌细胞的实验研究

目的构建人类MHC-Ⅰ类链相关基因A(MICA)的真核表达载体,转染人舌鳞癌脑高转移Tca8113-Tb细胞,建立稳定过表达MICA基因的口腔鳞癌细胞系。方法采用PCR技术扩增pCMV-SPORT6-MICA中编码MICA基因的cDNA序列,重组至有绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N1,构建最终的表达载体pEGFP-N1-MICA,脂质体法转染Tca8113-Tb细胞,G418筛选,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,有限稀释法建立稳定过表达MICA基因的Tca8113-Tb细胞系,RT-PCR、real time PCR和免疫细胞化学检测MICA在该细胞中的表达。结果通过PCR技术获取了MICA基因并成功克隆入载体,测序鉴定该序列与GenBank中的序列相同。转染的细胞可见绿色荧光蛋白表达,RT-PCR、real time PCR及免疫细胞化学检测到目的基因MICA在转染细胞中为过表达。结论 pEGFP-N1-MICA真核表达载体的成功构建与稳定转染Tca8113-Tb细胞系的建立,为进一步研究该基因的功能奠定了良好的实验基础。

灵长类主要组织相容性复合体Ⅰ类基因进化概述

主要组织相容性复合体(MHC)是和免疫反应直接相关的基因群。MHCⅠ类分子的多态性和病原体的多变性相对应,它是个体在重大传染疾病中存活下来的重要依据。在灵长类动物进化过程中,由于分化时间的差异和生存压力的不同,造成了各物种MHCⅠ类基因不同的存在状态,使它们的MHCⅠ类基因在基因数量和基因功能上有所差异,同时还产生了物种特异性基因。文章描述了灵长类MHCⅠ类基因的总体变化特征,并着重讨论了6个典型MHCⅠ类基因在各典型灵长类物种中的特点及关联性。

肾移植受者术前主要组织相容性复合物Ⅰ类链相关基因A抗体对移植后早期急性排斥反应的影响

目的探讨肾移植受者术前主要组织相容性复合物Ⅰ类链相关基因A（MICA）抗体对肾移植术后早期急性排斥反应和移植肾功能恢复的影响。方法检测2009年~2010年本院197例未使用免疫抑制剂的肾移植受者术前MICA抗体及其特异性,随访其后接受尸体肾移植手术的139例受者的术后早期急性排斥反应（AR）和移植肾功能。结果 197例肾移植受者术前MICA抗体阳性45例（22.84%）。MICA抗体特异性分析发现有11种抗体,其中出现频率最高的是抗MICA019（占65.7%）,出现频率最低的是抗MICA015（占8.6%）和抗MICA017（占8.6%）,高、低频率抗体间的差异具有显著性（χ2=24.48,P〈0.01）。45例阳性受者中单一特异性抗体18例（占51.4%）,多种特异性抗体17例（占48.6%）。197例受者中139例在术后有39例发生早期AR（占28.1%）;其中,45例术前MICA抗体阳性受者中38例接受移植后有14例发生早期AR（占36.8%）;152例术前MICA抗体阴性受者中有101例接受移植后有25例发生了早期AR（占24.8%）。结论中国人群中最常见的MICA抗体中为抗MICA019,推测MICA019为中国人群中较常见基因是其表现出临床上高频率抗体的原因。

B族Ⅰ型清道夫受体基因外显子1多态性与冠心病、血脂水平的关系

目的探讨B族Ⅰ型清道夫受体(SR-BⅠ)基因外显子1和内含子5单核苷酸多态性对中国天津地区汉族人群血脂水平和冠心病发病易感性的影响。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法,测定370例冠心病患者和143例正常对照者SR-BⅠ基因外显子1的AluI酶切基因型及内含子5的ApaI酶切基因型,分析其与血脂水平、冠心病及冠状动脉造影结果的关系。结果两组研究对象中内含子5均仅发现CC基因型。SR-BⅠ外显子1等位基因G、A频率在冠心病组和对照组分别为0.988、0.012和0.997、0.003。基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。外显子1 AluI酶切多态性基因型频率、等位基因频率组间比较均无显著性差异(P>0.05)。在冠心病组男性患者中,外显子1基因多态性变异组(GA+AA基因型亚组)的血清高密度脂蛋白胆固醇和载脂蛋白AⅠ水平高于无变异组(GG基因型亚组)。结论 SR-BⅠ基因外显子1多态性可能与中国天津汉族人群冠心病发病易感性及冠心病病变严重程度无关,但冠心病患者SR-BⅠ基因外显子1 A等位基因可引起男性血清高密度脂蛋白胆固醇和载脂蛋白AⅠ水平升高。

人Ⅰ型醇脱氢酶基因的克隆及其等位基因鉴定

[目的]克隆人Ⅰ型醇脱氢酶基因,并对所克隆序列进行鉴定。[方法]用RT-PCR法获得Ⅰ型醇脱氢酶基因的cDNA,然后用双酶切得到目的基因并定向克隆到pUC19载体上。经蓝白筛选后,用限制性酶谱和DNA测序以及BLAST比对分析,并结合Internet数据库和相关文献对基因进行鉴定。[结果]证实从一位病人癌旁正常肝组织中克隆的序列有人Ⅰ型醇脱氢酶基因的ADH1B*2、ADH1C*2和ADH1C*2,3个等位基因。[结论]用一对引物成功克隆了人Ⅰ型醇脱氢酶基因的3个等位基因,为进一步研究和利用Ⅰ型醇脱氢酶奠定了基础。

贵州省猪源沙门氏菌Ⅰ类整合子与耐药基因盒研究

为了调查规模养殖场沙门氏菌中Ⅰ类整合子的流行情况,采用聚合酶链式反应检测了从贵州省规模养猪场分离的57株沙门氏菌中Ⅰ类整合子的携带率以及整合子中耐药基因盒的种类;采用微量肉汤稀释法测定了57株沙门氏菌对12种抗菌药物的敏感性;并应用χ2检验检测Ⅰ类整合子阳性菌株与阴性菌株耐药性的相关性。结果显示,57株沙门氏菌中Ⅰ类整合子检出率为40.4%(23/57);耐药基因盒检出率为31.6%(18/57);整合子中携带可分别介导对氨基糖苷类和磺胺类药物耐药的aad A2、aad A5、aad A22、aad A23b、dfr A1、dfr A12和dfr A17基因;57株沙门氏菌对12种抗菌药物的耐药率不同,Ⅰ类整合子与多重耐药之间有明显的相关性。

中国甘肃地区汉族白血病易感性与HLA-Ⅰ类抗原之间的相关性(英文)

目的 :探讨中国甘肃地区汉族白血病易感性与HLA Ⅰ类抗原之间的相关性 ,找出白血病的易感基因。方法 :采用特异性寡核苷酸探针杂交 (PCR SSO)法 ,初步对 4 3名白血病病人和 6 6名健康对照进行了HLA Ⅰ抗原分型。结果 :经过SSPS 10 0统计软件分析 ,中国甘肃地区汉族白血病患者HLA A 0 1和HLA A 11基因的统计结果分别为X2 =6 35 0 ,P =0 0 2 8、X2 =5 5 74 ,P =0 0 18。显示相关性。结论 :中国甘肃地区汉族人群中HLA A 0 1和HLA A

湖南地区白血病MHC-Ⅰ类链相关基因A微卫星多态性分析

目的:探讨MHC-Ⅰ类相关链基因A(MHC class-Ⅰchain related gene A,MICA)与湖南地区白血病之间的相关性。方法:应用荧光聚合酶链反应-基因扫描技术和聚合酶链反应-序列特异性引物技术分析,对62例白血病患者和112名正常人群进行MICA基因第5外显子微卫星等位基因分型及MICA基因缺失检测。结果:慢性粒细胞白血病组(n=35)的MICA*A5基因频率显著低于正常对照组(RR=0.635,P=0.0380);急性淋巴细胞性白血病组(n=13)的MICA*A4基因频率显著低于正常对照组(RR=0.120,P=0.0297);而在急性非淋巴细胞性白血病组(n=14),MICA*A5基因频率显著高于正常对照组(RR=2.229,P=0.0218)。结论:本文数据显示,MICA-STR多态性与湖南地区白血病之间存在相关性;不同病理类型的白血病相关格局有所不同。

γ-干扰素基因的导入及删除对人肿瘤细胞HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原表达的影响

目的：制备有效的细胞因子基因修饰的肿瘤细胞作为“瘤苗”。方法：用缺陷型逆转录病毒作为载体将人γ－干扰素（ＩＦ－γ）含信号肽ｃＤＮＡ转导入人胃癌细胞株ＭＫＮ、４５，经Ｇ４１８筛选后得－ＩＦＮ－γ基因修饰株ＭＫＮ－４５－ＩＦＮ。ＰＣＲ方法测得有标记基因ＮｅｏＲ及ＩＦＮ－γ基因的存在，但经３个月连续传代培养后，ＰＣＲ仅能检测到ＮｅｏＲ基因，而未检出ＩＦＮ－γ基因、ＨＬＡ－Ⅰ、Ⅱ类单抗间接免疫荧光法流式细胞仪测定了上述相应时期ＩＦＮ－γ基因修饰肿瘤细胞ＨＬＡ－Ｉ、Ⅱ类抗原的表达。结果：随着ＩＦＮ－γ基因在染色体中被删除，ＨＬＡ－Ⅰ、Ⅱ类的表达又恢复至与ＭＫＮ－４５相同的水平。结论：为确保ＩＦＮ－γ基因的作用，应不断检测其基因的存在。

喉癌人类组织相容性抗原Ⅰ缺失与癌组织中淋巴细胞浸润的研究

目的 检测喉癌组织人类主要组织相容性抗原 (humanleucotyteantigen ,HLA)表达缺失情况 ,探讨其表达与肿瘤浸润淋巴细胞 (tumorinfiltratinglymphocyte ,TIL)及肿瘤细胞恶性度的关系。方法 2 0 0 1年 2月～ 2 0 0 1年 5月应用特异性鼠抗人HLAⅠ类分子等单克隆抗体与喉癌组织结合 ,通过免疫组化法 ,对 1993～ 1998年 6 4例手术切除喉癌标本进行检测。结果 6 4例喉癌组织中有 5 7例HLAⅠ抗原阳性表达 ,7例阴性表达 ,阴性表达率为 10 9% (7/ 6 4 ) ;HLAⅠ抗原阳性组织 ,浸润到肿瘤实质的CD+ 3 T细胞和CD+ 8T细胞数量明显多于HLAⅠ抗原阴性组织 ;随着HLAⅠ抗原表达下调 ,肿瘤细胞恶性度增加。随访 5 2例 ,3年生存率与HLAⅠ抗原缺失无关 (P >0 0 5 )。结论 部分喉癌组织存在HLAⅠ抗原丢失 ,且其丢失不利于细胞毒性T淋巴细胞向肿瘤实质浸润与杀伤。HLAⅠ抗原表达缺如 ,可能促进了细胞恶变的发生发展 。

SLAⅠ类基因研究新进展

SLAⅠ类基因编码细胞表面高度多态的糖蛋白,负责将内源性抗原肽递呈给T细胞,激发特异的免疫反应。文章介绍了近年来SLAⅠ类基因分子结构、组织中的表达、表达调节、基因分型、多态性及进化研究的新进展,重点介绍了SLAⅠ类基因分型方法及多态性研究。SLAⅠ类基因分型方法主要包括血清学法、DNA序列测定、PCR-SSP、PCR-SSOP、微卫星法,其中PCR-SSP法快速简便,在SLAⅠ类基因分型研究中应用广泛。文章对SLAⅠ类基因在基因功能、肽疫苗、异种移植等方面的研究和应用前景进行了讨论。

组织相容性Ⅰ类相关链A位点基因多态性在预判肾移植物排斥中的意义

目的研究组织相容性Ⅰ类相关链A位点（MICA）基因多态性和抗MICA特异性抗体在肾移植排斥反应发生中的意义。方法采用免疫磁珠液相芯片技术对40例肾移植患者在移植术前和移植术后1个月、3个月、6个月、1年和2年动态检测抗MICA抗体的特异性和阳性分值的变化,同时采用SSOP方法分析16对肾移植供受者的MICA基因分型,并把MICA基因具有相同抗原表位的特征性分为G1组和G2组。结果在40例肾移植中尸体供肾35例,亲缘活体供肾5例。35例肾移植受者均带肾存活良好,其中33例接受动态随访。移植术前预存抗MICA抗体为12例,其中抗MICA抗体10例、抗HLA-Ⅰ类＋MICA抗体2例;4例分为MICA-G1组、6例分为MICA-G2组、2例共为MICA-G1和G2组。16对供受者MICA等位基因频率分布：在MICA-G1组中频率M﹡002最高,M﹡007次之;MICA-G2组中频率M﹡008最高,M﹡009和M﹡019次之。33例移植术后有4例新生抗MICA抗体,3例新生抗HLA抗体,均为抗供者特异性抗体和抗非供者特异性抗体。移植术前预存抗MICA抗体,在移植术后1～2年的动态随访中其特异性均未改变,而抗体的阳性分值呈现高低的变化。12例移植术前预存抗MICA抗体中的3例和抗体阴性1例移植术后发生急性排斥反应,临床表现为发热,尿量减少,肌酐和肾动脉阻力指数升高。33例动态随访资料显示：无论是MICA基因频率分布特点,还是抗MICA特异性抗体类型与排斥反应的关系,M﹡002、M﹡004、M﹡008、M﹡019和M﹡001基因型最常见,但未见MICA﹡012和MICA﹡006基因型。结论移植术前分析供受者的MICA基因多态性,受者的特异性抗体鉴定和特征性分组;移植术后动态监测抗MICA抗体的变化,是肾移植术后预防急性和慢性移植物排斥的重要靶分子。