用RT-PCR和Genescan分析CML急变期病人TCRVβT细胞的表达和克隆性

目的：了解CML急变期的TCRVβ亚家族T细胞的表达及其克隆性。方法：采用RT－PCR扩增4例CML急变期病人的外周血单个核细胞的TCRVβ24个亚家族的互补决定区3（CDR3），产物进一步经基因扫描分析确定T细胞的克隆性。结果：病人外周血仅表达4～9个Vβ亚家族T细胞，主要为Vβ1，Vβ2，Vβ3，Vβ5，Vβ15和Vβ17；基因扫描分析显示2例CML急粒变的部分产物为寡克隆性，而2例CML急淋变者的产物均为多克隆性。结论：CML急变期外周血仅选择性表达部分Vβ亚家族T细胞；CML急粒变存在克隆性增殖T细胞，这可能是机体对白血病细胞相关抗原的一种直接反应。该方法可用于检测微小残留病变和判断疾病复发。

枣CML基因的分子特征及其抗寒性表达模式分析

【目的】探究枣类钙调蛋白(ZjCML)在抗寒性中的重要作用,旨在挖掘关键抗寒ZjCML基因,为进一步利用其进行枣抗寒育种提供理论参考。【方法】本研究利用生物信息学技术,全面分析了枣CML基因家族成员的数目及相关结构特征,并利用RNA-seq和实时荧光定量PCR技术分析其响应低温胁迫时的表达模式,为筛选关键抗寒基因奠定基础。【结果】在枣基因组数据中共鉴定到23个ZjCML基因,不均匀地分布在12条染色体上。与拟南芥CMLs蛋白构建进化树分析发现ZjCMLs可被分为12个类群。蛋白网络互作预测发现16个ZjCMLs存在于该网络中,且具有一定的互作关系。RNA-seq结果表明ZjCML13和ZjCML6基因表达模式在‘冬枣’及其同源四倍体响应低温胁迫中具有显著差异,其中ZjCML13在‘冬枣’响应低温胁迫6和24 h时极显著上调表达,而在‘冬枣’同源四倍体中表达差异不显著。外源Ca Cl2和褪黑素处理后,ZjCML13在‘冬枣’同源四倍体响应低温胁迫6和24 h时极显著上调表达,说明其可能通过诱导ZjCML13表达调控‘冬枣’同源四倍体抗寒性。【结论】枣CML基因家族具有特定的结构特征及响应低温胁迫,ZjCML13可能在调控‘冬枣’及其同源四倍体抗寒性差异中发挥重要作用。

CML患者骨髓单个核细胞基因表达谱分析

目的探讨慢性髓细胞性白血病(CML)的基因表达变化。方法分别从正常人和CML患者骨髓样品中抽取骨髓单个核细胞,分离出cDNA片段,然后再逆转录成cRNA并标记后,与人的全基因组表达谱芯片杂交,ABI1700芯片分析系统进行分析基因表达谱的差异。结果总共发现差异表达的基因有6706个,其中与CML相关的差异基因有75个(上调19个,下调56个)。结论全基因组寡核苷酸基因芯片在分析基因表达谱差异研究中具有广泛的应用价值。

CML细胞诱导自体和脐血T细胞TCR Vβ谱系和杀伤性分析

目的 了解慢性粒细胞白血病 (CML)细胞诱导T细胞的TCRVβ亚家族限制性利用和克隆性增殖情况 ,及其对CML细胞的杀伤活性。方法 采用混合淋巴细胞 肿瘤细胞培养 (MLTC)方法 ,利用CML细胞体外诱导脐血或患者的T细胞增殖 ,用RT PCR和基因扫描分析MLTC前后T细胞的 2 4个TCRVβ亚家族基因的互补决定区 (CDR3) ,了解各Vβ亚家族的利用和T细胞克隆性特点。并利用LDH方法检测MLTC后T细胞的细胞毒性。结果 脐血T细胞表达 8～ 11个TCRVβ亚家族 ,经MLTC后 ,2～ 3个Vβ亚家族呈克隆性增殖 ,CML细胞诱导的自体T细胞的TCRVβ亚家族也类似。经MLTC后T细胞对原诱导细胞有较强的杀伤活性。结论 CML细胞可诱导脐血T细胞和自体T细胞TCRVβ优势利用和克隆性增殖 ,诱导后T细胞具有特异性杀伤CML细胞的作用。

甜樱桃类钙调蛋白基因家族的生物信息学分析

类钙调蛋白(CML)是植物生长发育过程中应对刺激的一种重要蛋白,基于甜樱桃全基因组,利用生物信息学的方法对甜樱桃CML基因家族成员进行鉴定,并对理化性质、染色体定位、基因结构、启动子作用元件等进行分析。结果表明,PavCML家族有49个基因,不均匀的分布于1~8号染色体上,亚细胞定位在细胞质、叶绿体、细胞核等部位,启动子顺式作用元件分析发现PavCML家族基因响应多种元件。与转录组数据结合进行荧光定量PCR分析,结果显示CML在裂果部位的相对表达量高,表明该基因可能参与裂果过程,为CML家族基因的功能鉴定提供理论依据。

CML相关抗原诱导正常T细胞增殖的TCR Vα基因选用和克隆性研究

目的:了解慢性粒细胞白血病(CML)相关抗原体外诱导T细胞的TCR Vα亚家族限制性表达和克隆性增殖情况。方法:采用混合淋巴细胞和肿瘤细胞培养(MLTC)方法,利用CML细胞、K562细胞和bcr3-abl2多肽体外诱导脐血或正常人的T细胞增殖,用RT-PCR和基因扫描分析MLTC后T细胞的29个TCR Vα亚家族基因的互补决定区(CDR3),了解各Vα亚家族的限制性表达情况和T细胞克隆性增殖特点。结果:经CML抗原刺激后增殖的T细胞仅表达部分Vα谱系基因(1-14个亚家族),两例脐血均出现有Vα3亚家族T细胞克隆性增殖趋势;正常人外周血出现寡克隆增殖的Vα5、Vα14亚家族T细胞。结论:CML相关抗原体外诱导脐血和正常人T细胞出现抗原相关的TCR Vα优势利用和克隆性增殖。

CYP3A5基因和MDR1基因位点的单核苷酸多态性与CML细胞遗传学复发风险的关系分析

目的:分析CYP3A5基因和MDR1基因位点的单核苷酸多态性(SNP)与慢性髓系白血病(CML)细胞遗传学复发风险的关系。方法:收集本院收治的90例行伊马替尼治疗的CML患者的临床资料,根据有无复发进行分组,并分析CYP3A5基因和MDR1基因位点的SNP与CML细胞遗传学复发风险的关系。结果:无细胞遗传学复发者41例(无复发组),复发者49例(复发组),随访36个月。相比MDR1基因位点中的C3435T、C1236T的TT+CT基因型的患者,CC基因型的患者细胞遗传学复发的几率显著升高(P <0. 05)。相比MDR1基因位点中的C3435T的CT+CC基因型的患者,TT基因型的患者细胞遗传学复发的几率显著下降(P <0. 05)。相比MDR1基因位点中的C1236T、C3435T的CT、CC基因型患者,TT基因型者无复发生存期明显延长(P <0. 05)。相比无复发组,复发组中性粒细胞减少症(29. 27%vs 71. 43%)、血液毒性(39. 02%vs 61. 22%)的发生率显著升高(P <0. 05)。伊马替尼剂量(OR=2. 95,95%CI:1. 37-7. 76)与MDR1基因中的C3435T基因型(OR=0. 09,95%CI:0. 05～0. 72)是CML患者细胞遗传学复发的影响因素(均P <0. 05)。结论:伊马替尼治疗剂量与MDR1基因中的C3435T、C1236T基因型对CML患者细胞遗传学复发造成一定的影响,其中MDR1基因中的C3435T基因型对评估患者细胞遗传学复发风险具有一定的预测价值,因此可作为一种临床潜在的生物标志物。

两种兰科植物CaM及CML基因家族全基因组分析

[目的]探讨Ca M和CML基因家族在兰科植物不同组织和与菌根真菌建立共生关系过程中的潜在功能。[方法]依据已发表的拟南芥Ca M和CML基因家族蛋白序列,利用生物信息学方法对小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛全基因组进行搜索,通过多种生物软件或在线工具对Ca M和CML基因家族蛋白序列进行筛选及确定、蛋白结构分析、系统进化分析及结构域预测;利用转录组数据绘制heatmap图,对小兰屿蝴蝶兰不同组织(花、叶、茎、根)及石斛种子与美胞胶膜菌共生条件下Ca M和CML基因家族的表达情况进行分析。[结果]在小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛全基因组中均预测到4个Ca M蛋白和54个CML蛋白;小兰屿蝴蝶兰Ca M及CML家族基因中39个基因没有内含子,19个基因具有内含子;铁皮石斛Ca M及CML基因家族中有41个基因没有内含子,17个基因具有内含子;系统进化分析将小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛Ca M和CML蛋白家族各分为10个亚家族;小兰屿蝴蝶兰中9个基因在叶中的表达相对于花、茎、根为上调表达,2个基因在叶中的表达相对于花、茎、根却为下调表达; 3个基因在花中的表达相对于叶、茎、根为上调表达; 3个基因在花和叶中的表达相对于茎和根为上调表达;铁皮石斛中4个基因在与美胞胶膜菌共生萌发文库中的表达相对于非共生文库为上调表达; 4个基因在共生萌发文库中的表达相对于非共生文库为下调表达。[结论]Ca M及CML家族基因在兰科植物不同组织具有重要作用,且参与铁皮石斛种子与美孢胶膜菌共生萌发的生物学调控过程。

CML患者外周血TCR Vγ亚家族T细胞的谱系变化研究

目的探讨慢性粒细胞白血病(CML)慢性期(CP)和缓解期(CR)患者外周血T细胞中T细胞受体(TCR)Vγ基因谱系的分布和克隆性情况。方法利用RT-PCR检测8例CML-CP和8例CML-CR患者外周血T细胞3个TCR Vγ亚家族的表达,了解TCR Vγ亚家族T细胞的分布和利用情况;阳性产物进一步经荧光素标记和基因扫描分析CDR3长度,从而了解其克隆性。10例健康成人外周血作为对照。结果8例CP期和8例CR期的CML患者外周血T细胞平均分别为(1.88±0.64,2.13±0.83)个亚家族,两者比较尚无统计学差异,但均明显低于健康对照组(P=0.000,P=0.036)。CP和CR期患者TCR VγⅢ的表达率明显低于健康对照组(2.9±0.32)(P=0.013,P=0.043),基因扫描显示CML-CP和CML-CR出现克隆模式的改变主要集中在TCR VγⅡ亚家族。结论CP期患者外周血TCRVγ基因谱系出现限制性利用和克隆性增殖T细胞,主要可能与患者处于细胞免疫抑制状态有关,即使CR期患者其T细胞仍处于一定程度的免疫抑制状态。

CML患者外周血TCR Vδ亚家族T细胞的谱系变化研究

目的了解慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者慢性期(chronic phase,CP)和缓解期(complete remission,CR)外周血T细胞受体(T cell receptor,TCR)Vδ亚家族T细胞的分布和克隆性情况。方法利用RT-PCR扩增8例CML-CP和8例CML-CR患者外周血T细胞中8个Vδ亚家族基因的互补决定区(CDR3),了解TCR Vδ亚家族T细胞的分布和利用情况;阳性产物进一步经基因扫描分析CDR3长度,从而了解其克隆性。10例健康人外周血作为对照。结果8例CML-CP患者外周血T细胞平均表达(3.25±0.89)个Vδ亚家族,主要以Vδ1、Vδ2和Vδ3的表达为主,而8例CR期患者则平均表达(3.50±0.76)个Vδ亚家族,主要集中在Vδ1、Vδ2、Vδ3和Vδ8中表达;两组与健康对照组(3.50±0.52)比较无统计学意义。此外,Vδ8表达频率在CML-CR患者(5/8)中略高于健康人(3/10)和CML-CP患者(2/8)。基因扫描绝大多数患者和健康人外周血TCR Vδ亚家族T细胞均存在克隆性增殖现象,主要以Vδ1-Vδ3为主,但在CML-CR患者中,表达Vδ7亚家族的两例样本均呈克隆性增殖,这在10例健康人中均未检测到。结论3组样本的外周血T细胞中TCR Vδ谱系和克隆性增殖类似,提示CML患者T细胞免疫抑制可能并不主要累及TCR Vδ谱系变化,并在CML-CR期所出现了一些不同的Vδ表达和克隆模式。

慢性髓系白血病疾病进展相关基因的生物信息学分析与初步实验验证

本研究探讨慢性髓系白血病(CML)的疾病进展机制,为该疾病临床转归的评估及治疗选择提供新的分子标志物。从NCBI数据库GEO下载一组与CML疾病进展相关的基因芯片数据,利用生物信息学工具分析并得到与加速期(AP)和急变期(BC)相关的基因集,将这两组基因集进行信号通路分析和网络图谱分析得到与进展相关的关键基因和信号通路,并应用荧光定量PCR方法对其中的关键基因进行初步实验验证。结果表明,将AP相关基因和BC相关基因交叉比较,得到在AP和BC都有异常表达的9个基因;信号通路分析发现,整合素介导的细胞黏附,黏着斑细胞粘附以及细胞骨架调节在AP和BC始终发生异常;网络构建分析发现,关键节点的基因分别是MLLT4,WDR35和EPHB4。应用荧光定量PCR方法对疾病进展期和慢性期的患者进行比较发现,EPHB4在进展期的表达水平显著高于慢性期。结论:发现了与CML进展相关的9个基因,其中MLLT4,WDR35,EPHB4基因可能是导致CML进展的关键基因。

BCR／ABL融合基因和转录因子FoxO3a在初发和急变慢性粒细胞白血病患者中的表达变化

目的:观察慢性粒细胞白血病(CML)初发和急变患者外周血BCR/ABL融合基因和转录因子FoxO3a的表达变化及其意义。方法:利用EVA Green建立实时荧光RT-PCR检测BCR/ABL、FoxO3a和GAPDH的方法,检测25例CML初发和25例CML急变患者的外周血样本中BCR/ABL融合基因和FoxO3a的表达,以及30例正常人外周血样本中FoxO3a的表达,以GAPDH为内参基因,各组基因表达水平的差异采用△△CT相对定量法。结果:CML急变患者外周血BCR/ABL融合基因的表达水平是初发患者的4.72倍,正常人外周血样本中FoxO3a的表达水平分别是CML初发和急变患者的143.39倍和8.18倍。结论:BCR/ABL融合基因的高表达与转录因子FoxO3a的低表达可能与CML不同阶段的病理过程相关联。

运动发酵单胞菌定点整合质粒的构建

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是目前发现的乙醇发酵能力最强的微生物之一,被认为是进行大规模乙醇生产的潜在菌种,但其可利用的碳源范围窄.对其进行分子生物学基础研究和基因工程改造的工作早在上世纪八、九十年代就开始了,但基于其独特的生物学特性,至今遗传操作手段仍不成熟.以大肠杆菌(E.coli)pBR328为出发质粒,分段插入带Z.mobilis乳酸脱氢酶基因ldh、分别作为左右同源臂、1.5 kb大小的DNA片段,构建了Z.mobilis定点整合型质粒pBR328-ldhR-ldhL(6 239 bp),此质粒两同源臂片段即ldhR和ldhL的中间有稀有酶切位点NotI和SfiI,以方便插入待整合片段.经NotI位点插入1 216 bp氯霉素抗性基因cml,将相应质粒pBR328-ldhR-cml-ldhL以环型和线型形式分别电击转化Z.mobilis ZM4菌株,都成功筛选到了ZM4 ldh::cml菌株,证明此定点整合质粒是方便可用的,为对Z.mobilis的定点遗传操作提供了很好的基础.

慢性粒细胞白血病患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性的研究

目的:了解慢性粒细胞白血病(CML)患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)基因型及单倍型,为探讨KIR在慢性粒细胞白血病中发挥的作用奠定基础。方法:采用PCR-SSP方法对84例慢性粒细胞白血病患者进行KIR基因分型。结果:框架基因2DL4、3DL2、3DL3及3DP1存在于所有个体中,其他较为高频的基因依次为2DL1、2DL3、2DP1及3DL1,表型频率均>80%。CML患者的KIR2DL2和KIR2DS2表型频率较健康人有所降低,但除2DL5B(OR=0.208,P<0.05)外,分析的所有基因在CML患者和健康人间的分布均不具有显著差异。结论:基因KIR2DL5B可能与CML之间存在相关性。

非血缘异基因外周血干细胞移植治疗慢性粒细胞白血病的临床研究

目的确保重庆市首例非血缘异基因外周血干细胞移植(URD-PBSCT)治疗慢性粒细胞白血病成功。方法对接受URD-PBSCT的慢性粒细胞白血病患者移植过程进行总结分析。结果患者造血重建迅速,中性粒细胞>0.5×109/L,血小板>20×109/L的时间分别为+13d、+16d,+17d患者的血型由O型转变为供者的B型,并经STR复检证实患者的性染色体由XY转为供者型的性染色体XX;移植过程中未见GVHD、VOD等严重并发症,骨髓细胞bcr/abl融合基因于+27d检查完全消失,+100d再次复查仍为阴性。结论重庆市首例URD-PBSCT治疗慢性粒细胞白血病患者获得圆满成功,URD-PBSCT可成为某些白血病得以根治的重要手段。

慢性髓性白血病bcr-abl融合基因的克隆与表达

以慢性髓性白血病K562细胞总RNA为模板,采用RT PCR技术扩增包含bcr abl融合位点周围的基因片段,定向克隆到pGEX 6P 1载体谷光甘肽S转移酶(GST)的下游。将重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株,以1.0mmol·L-1IPTG诱导bcr abl融合基因片段的表达,其产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,结果证实该融合蛋白分子质量约42ku。用该表达产物免疫ICR小鼠,所制备的抗血清可与K562细胞中特异性抗原反应,表明该bcr abl/GST融合蛋白具有bcr abl基因产物的特异抗原性。

慢病毒介导shRNA稳定干扰P210^(bcr/abl)基因表达的体内外研究

P210bcr/abl融合基因在慢性髓系白血病(CML)发生、发展中起重要作用。针对P210bcr/abl融合基因的小分子抑制剂(如伊马替尼)治疗CML非常有效,但容易产生耐药性。P210bcr/abl基因的融合区为RNA干扰其表达提供了一个特异性靶点。本研究通过病毒载体建立能同时表达P210bcr/ablshRNA和P210bcr/abl基因的BaF3细胞系,并探讨慢病毒介导的shRNA对P210bcr/abl基因表达的作用。用荧光显微镜检测慢病毒对BaF3细胞的感染率,用台盼蓝拒染法检测细胞的增殖能力;用RT-PCR和Western blot分别检测P210bcr/ablmRNA和蛋白的表达。结果发现,P210bcr/ablshRNA能使BaF3-P210bcr/abl细胞中的P210bcr/ablmRNA及蛋白表达明显下降,并且能增强BaF3-P210bcr/abl细胞对伊马替尼的敏感性,与不表达P210bcr/ablshRNA的BaF3-P210bcr/abl细胞相比,伊马替尼对该细胞系的IC50下降50%以上。将该细胞由尾静脉移植到受致死剂量照射的裸小鼠体内,移植该细胞的小鼠生存期较移植BaF3-P210bcr/abl细胞的小鼠生存期明显延长。结论:稳定表达针对P210bcr/abl基因融合区的shRNA可能增强CML常规治疗的效果。

间期双色双融合荧光原位杂交监测慢性髓系白血病异基因造血干细胞移植后bcr/abl融合基因

本研究探讨bcr/abl双色双融合荧光原位杂交(DD-FISH)的敏感性及临床应用价值。对19例慢性髓细胞白血病(CML)异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后微小残留病灶(MRD)用DD-FISH进行监测,同时与常规细胞遗传学(CC)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结果相比较。样本取自骨髓,少数来源于骨髓片或外周血。结果表明:14例CML患者在Allo-HSCT后CC显示持续正常供者核型,RT-PCR转为阴性,移植2月后均为完全供者嵌合(DC),DD-FISH检测结果持续为阴性,平均随访11.25月,MRD无增加。1例CC及RT-PCR阴性,而性染色体FISH为混合嵌合,DD-FISH阳性,监测无MRD增加,临床未治疗,疾病稳定。3例骨髓复发患者的DD-FISH及性染色体FISH均提示MRD明显增加,RT-PCR转为阳性,却只有1例CC异常,供者淋巴细胞输注(DLI)及甲磺酸伊马替尼治疗后均为DC,DD-FISH阴性,RT-PCR阴性。1例骨活检证实髓外复发患者骨髓或外周血样本的DD-FISH、CC及PCR均阴性,供受者完全嵌合。结论:间期双色双融合FISH可应用于CML异基因造血干细胞移植后MRD的监测,其操作简易快速,灵敏度高,且骨髓或外周血均可采用。动态监测能及时发现扩大的白血病细胞克隆。

慢性粒细胞白血病患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因研究

目的探索CML患者的KIR(killer cell immunoglobulin-like receptors)基因的多态性与正常人群是否存在差异。方法应用PCR-SSP技术进行KIR基因的检测。结果共检出目前已知的18个KIR基因,在检测的全部个体中,3DL3,3DL2及2DL4出现频率均为100%。在CML的研究中发现KIR2DL1基因频率(0.509)比正常对照组(1.000)显著降低,KIR2DL1与CML呈现强负相关P<0.001,与CML负相关的KIR基因尚有3DS1,2DL5和3DL1,P值分别等于0.021,0.029,0.031。其他KIR基因位点频率未发现统计学差异。结论CML患者具有其独特KIR基因位点频率的特点。

RT-PCR一步法检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因

应用RT PCR一步法检测了 42例慢性粒细胞白血病 (CML)患者的bcr/abl融合基因 ,均显示bcr/abl基因阳性 ,其中2 1例为 16 8bp扩增带 ,18例为 93bp扩增带 ,3例同时具有 16 8bp和 93bp二条扩增带。bcr/abl融合基因检测 ,对CML的诊断、治疗及预后判断均有重要意义。RT PCR一步法特异性好 ,敏感性高 ,简单快速 ,可节省试剂 ,值得推广应用。