双水相萃取法分离低温α-淀粉酶的研究

对利用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)-磷酸盐双水相体系从Pseudoalteromonas arctic GS230发酵液中直接萃取分离低温α-淀粉酶进行研究。探讨PEG分子量、相浓度、pH值对低温α-淀粉酶在PEG-磷酸盐双水相中分配系数、纯化系数及回收率的影响,并进行直线放大实验。结果表明:在pH5.0,PEG-100015%-磷酸盐15%的双水相体系中,低温α-淀粉酶的纯化系数及回收率分别为4.8和87%。

α-淀粉酶低温适应性分子机制的研究进展

低温酶由于在低温下仍能保持高催化活性而具有很高的工业应用价值。而关于低温酶是如何适应低温环境以及在低温下如何保持高催化活性等问题,同样引起了各国科学家们的广泛关注。其中低温α-淀粉酶是在结构和功能方面研究得最为透彻的酶,它也是第一个被结晶的低温酶,其热、动力学特征已通过内荧光法、圆二色性和差示扫描量热法等进行了深入研究。建立在三维结构分析和热力学特征研究的基础上,科学家们目前正尝试着解开低温酶的低温适应性之谜。对低温α-淀粉酶的研究进展作一简要的综述。

海洋低温α-淀粉酶酶解豌豆淀粉及其生物活性

豌豆淀粉是一种广泛用于食品加工的重要的食品原料,采用研制的新型海洋低温α-淀粉酶,结合单因素试验和正交试验优化了α-淀粉酶酶解豌豆淀粉的工艺参数,并对酶解产物的生物活性进行了研究。结果表明,低温α-淀粉酶酶解豌豆淀粉工艺条件为加酶量35 U/g,时间165 min,温度35℃,豌豆淀粉浓度4%,pH6.5。经高效液相色谱(HPLC)分析,酶解产物中麦芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖的总和达到65.88%。酶解产物对羟自由基和DPPH自由基均有清除作用,对DPPH自由基的清除效果好于对羟自由基的清除效果。为豌豆淀粉的深入加工提供了参考。

产冷适应复合酶菌株Pseudomonas sp.NJ197的选育、发酵条件及酶学性质

从南极普利兹湾深海沉积物中筛选到一株同时产多种冷适应酶的菌株NJ197，细菌学形态鉴定及16SrDNA序列分析表明，该菌株属于假单胞菌属（Pseudomonas）．生长特性研究表明，该菌株属于耐冷菌，其最适生长温度为5～15℃．NJ197菌株能利用多种单一的碳、氮源产酶，最适产酶温度为20℃，最高产酶温度为30℃．粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE cellulose-52柱层析初步分离纯化后进行酶学性质的研究．该菌株所分泌复合酶中脂肪酶和淀粉酶的活力最高，它们的最适作用温度分别为30℃和35℃，最适pH值分别为9．0和9．5，对热敏感，是典型的碱性冷适应复合酶．Ca^2＋、Mn^2＋、Cu^2＋、Co^2＋、Fe^3＋对该复合酶有较为明显的激活作用，而Zn^2＋、Hg^2＋、Rb^2＋、Cd^2＋、EDTA则能抑制酶活．其中脂肪酶能在高浓度的SDS、CHAPS等变性剂中表现出较好的稳定性．

气单胞菌低温淀粉酶基因的克隆及生物信息学分析

【目的】获得低温菌LA77的低温淀粉酶基因及其生物学信息。【方法】用16S r DNA序列分析对其进行了分子鉴定,并根据分类地位进行了特异引物设计和PCR扩增,通过生物学网站和软件对获得的基因及编码蛋白进行分析。【结果】低温菌LA77归属于气单胞菌属,PCR扩增获得一条编码703个氨基酸的完整开放阅读框的基因。通过生物信息学分析显示该蛋白质理论分子量约为77.9 k D,等电点为6.16,为亲水、且具有信号肽的跨膜蛋白。可能存在10个磷酸化位点,1个糖基化位点,二级结构主要由α螺旋和随机卷曲构成。基于氨基酸序列的结构域和系统进化树分析表明,该蛋白属于α-淀粉酶家族,极可能为低温淀粉酶。【结论】LA77低温淀粉酶基因的获得,将为低温淀粉酶基因的进一步改造、表达以及其酶低温催化机理的阐释奠定重要的基础。

北极海冰低温微生物的生长条件及其胞外水解酶的研究

对北极海冰获得的14株低温微生物进行培养条件和胞外水解酶活力的研究,结果表明:(1)菌株最适生长温度均为15℃和20℃左右,最适pH在8.0左右,在酸性条件下几乎不生长。生长需要一定浓度的盐,在3%NaC l的培养基中能很好的生长,而在没有NaC l的培养基中不生长。(2)14株菌株能不同程度的分泌胞外水解酶。(3)菌株i429,i539在低温下产纤维素酶的活力最高,具有低温酶的特性。

腊样芽孢杆菌低温淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

从废弃的淀粉堆中筛选到一株产低温淀粉酶的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)GXBC-1,通过同源保守序列比对,从中克隆到一个淀粉酶基因。该基因全长为1 764 bp,编码588个氨基酸,分子量约为64kD。将基因克隆到大肠杆菌进行表达及酶学性质研究,该重组酶最适温度为35℃,在20℃仍具有53%的活力;最适pH值为7.0,Km值为0.72 mg/mL。产物经HPLC分析,该酶没有内切酶活性,具有典型的β-淀粉酶特性。

海洋低温α淀粉酶水解玉米淀粉及其产物生物活性

本研究旨在开发适用于工业生产的新型酶制剂,采用研制的新型海洋低温α-淀粉酶,研究该酶水解玉米淀粉最佳工艺条件以及其产物特性。低温α-淀粉酶最佳的工艺条件为温度30℃、时间90 min、淀粉浓度4.5%、加酶量8 U/g、p H6.5。酶解产物通过TLC和HPLC分析,酶解产物中主要为麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖,其中麦芽四糖和麦芽五糖的和达到69.62%。酶解产物对羟自由基和DPPH自由基均有清除作用,对羟自由基的清除效果要好于对DPPH自由基的清除。

C端柔性区域对多糖降解菌来源的麦芽五糖生成酶冷适性的调控

冷适麦芽五糖生成酶在低温下具有较高的催化活力,同时能够在室温下快速水解淀粉并特异性地生成具有营养功效的麦芽五糖,因此在食品、医药等领域具有广阔的应用前景。作者以来源于Saccharophagus degradans的两种麦芽五糖生成酶(SdG5A和SdG5A-CD)为研究对象,将其分别表达于Bacillus subtilis中,并分析比较了重组酶的冷适性。结果表明,重组SdG5A在0℃下可以保持27.8%的酶活力,在室温下生产麦芽五糖的得率高达48.6%,具有较强的冷适性;而不含有linker和淀粉结合域(SBD)的SdG5A-CD不具有冷适性。为了探究SdG5A的冷适性机理,利用RoseTTAFold构建了结构模型,并利用分子动力学模拟等方法分析了结构柔性。结果表明,位于SdG5A C端的linker-SBD区域具有极高的柔性,且在0℃下的均方根涨落与45℃保持一致,说明linker-SBD结构高柔性的分子特征是影响SdG5A冷适性的关键因素。

低温淀粉酶菌株分离及其酶学性质研究

通过淀粉底物平板从南极土壤中分离筛选出一株产淀粉酶的菌株,通过16S rDNA鉴定为氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)菌株.酶学性质表征发现该酶的最适温度为20℃,最适pH为9.0.摇瓶发酵2 d,酶的比酶活为15.7 U/mg.Ca^(2+)和Mg^(2+)对其有激活作用,而Hg^(2+)和Ni^(2+)是该酶的强力抑制剂.同时,该酶不但可以水解直链淀粉,还可以水解支链淀粉,表现出较宽泛的底物选择性.以上结果表明Arthrobacter oxydans产生的淀粉酶符合低温淀粉酶的特性,在食品上有一定的应用前景.

天山一号冰川产淀粉酶酵母菌的筛选及其系统发育分析

[目的]筛选并分析天山一号冰川冰层产淀粉酶的低温酵母菌。[方法]对天山一号冰川冰层含冰冻土产低温淀粉酶的低温酵母菌菌株进行筛选、纯化,并对其生理多样性和系统发育多样性进行研究。[结果]从天山一号冰川冰层含冰冻土中分离出60株酵母菌,并从中筛选出6株产低温淀粉酶的菌株,根据细胞菌落形态、菌体特征和26S rDNA D1/D2区域序列系统发育分析,6株菌分别隶属于红酵母属（Rhodotorula）、隐球菌属（Cryptococcus）和掷孢酵母属（Sporobolomyces）,最适生长温度为20~24℃,为兼性耐冷细菌。[结论]研究可为了解冰川酵母菌的系统发育多样性以及低温淀粉酶的生物技术研发奠定基础。

嗜热子囊菌Thermoascus crustaceus JCM12803来源的低温α-淀粉酶功能验证及其适冷机制分析

【目的】挖掘新颖的低温α-淀粉酶基因资源,并对其适冷机制进行分析,可以加深我们对低温酶的认识并为酶分子改良提供科学依据。【方法】根据嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus) JCM12803全基因组序列信息,利用PCR的方法获得一个α-淀粉酶基因Tcamy,将其插入至表达载体pPIC9后,在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115中异源表达,测定其酶学性质。同时采用氨基酸序列分析和同源建模的方法获得其三维结构,分别从蛋白序列-结构-功能层面上研究其适冷机制。【结果】Tc Amy是一个典型的低温α-淀粉酶,最适温度35°C,在0°C下保持有27%的活性。序列和结构分析表明该酶N-糖基化修饰程度低,Arg和Pro含量低而Gly含量高且二硫键和离子键较少。【结论】本研究获得了一个低温α-淀粉酶,低N-糖基化以及特殊的氨基酸组成和蛋白分子内作用力是其适应低温的根本原因。

一株耐冷菌所产降解酶的特性及应用

从我国寒冷地区筛选到一株能产低温降解酶的菌株.细菌学形态及16S rDNA鉴定表明,该菌株属希瓦氏菌属(Shewanella),最适生长温度为5～15℃,属耐冷菌,并暂命名为Shewanella sp.J5.菌株J5分泌的降解酶中蛋白酶和淀粉酶所表现的活力较高,在0℃下分别仍能保持20%和40%的酶活性,最适温度分别为40℃和30℃,最适pH分别为8.0和7.0～10.0,且对热敏感,属于碱性低温酶;金属离子中Mn2+、Fe2+对蛋白酶有明显的促进作用,而淀粉酶对金属依赖性较小;HPSEC结果表明,低温蛋白酶在水解酪蛋白过程中,对相对分子质量>10 000的大分子肽水解能力很强.脱氢酶酶活测定结果表明,低温下菌株活性显著高于常温活性污泥,5℃下,添加菌株J5到活性污泥中可使废水COD去除率提高33%.因此,该菌株在低温污水处理上具有一定的应用前景.

南极微球菌产低温淀粉酶条件优化及酶学性质初步研究

采用单因素试验对南极微球菌（Micrococcus antarcticus）产低温淀粉酶的条件进行了初步优化,其发酵培养基组成为（g/L）：Na2HPO42.0,KH2PO41.0,MgSO4.7H2O 0.1,NaCl 5.0,（NH4）2SO42.5,麦芽糖5.0,微量元素溶液5.0 mL,pH 8.0,500 mL三角瓶装液100 mL,12℃,160 r/min振荡培养64 h,在此条件下,发酵液酶活由优化前的0.24 U/mL提高到2.6 U/mL,是优化前的10.8倍.发酵液经Millipore超滤膜包浓缩、Hitrap Q阴离子交换层析、Superdex 200凝胶过滤层析纯化获得纯淀粉酶.该淀粉酶的最适作用温度为30℃,在10-15℃下仍具有较高活性,但对热敏感,属典型的低温酶;最适作用pH为6.0,在pH 6.0-10.0范围内较稳定（〉70%）;Ca^2＋、Mn^2＋、Co^2＋、Mg^2＋对该酶有较为明显的激活作用,而Zn^2＋、Ba^2＋、Ag^＋、Cu^2＋、Al^3＋、Fe^2＋、Fe^3＋、Hg^2＋、螯合剂EDTA、citrate则对该酶有不同程度的抑制作用,并且在Tween系列及TrintonX-100等非离子型表面活性剂中表现出较好的稳定性;酶的动力学参数Km为0.90 mg/mL.