慢性阻塞性肺疾病患者外周血中冷诱导RNA结合蛋白和髓样细胞触发受体-1的表达水平及其临床意义

目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血中冷诱导RNA结合蛋白(CIRBP)和髓样细胞触发受体-1(TREM-1)的表达水平及其临床意义。方法选取2022年10月—2023年6月40例住院的COPD患者为急性加重期组,其经过治疗进入稳定期后纳入稳定期组,同期40例健康体检者为对照组。收集各组一般资料,采集外周血,通过酶联免疫吸附法测定血浆中CIRBP、TREM-1水平,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法测定CIRBP mRNA和TREM-1 mRNA的相对表达量,并检测COPD患者和健康体检者的肺功能。结果COPD急性加重期外周血中的CIRBP、TREM-1表达水平均高于稳定期组,差异有统计学意义(均P<0.001);急性加重期和稳定期外周血中的CIRBP、TREM-1表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(均P<0.001);在急性加重期和稳定期,CIRBP水平均与TREM-1水平呈正相关;急性加重期CIRBP、TREM-1水平与白细胞计数、中性粒细胞百分比、中性粒细胞/淋巴细胞比率呈正相关;稳定期CIRBP、TREM-1水平与第1秒用力呼气容积占预计值百分比、第1秒用力呼气容积/用力肺活量比值呈负相关,与白细胞计数、中性粒细胞百分比、中性粒细胞/淋巴细胞比率呈正相关。结论CIRBP和TREM-1的表达水平在COPD患者外周血中升高,CIRBP的表达与TREM-1表达具有相关性,并且与肺功能、白细胞计数、中性粒细胞百分比、中性粒细胞与淋巴细胞比率、单核细胞与高密度脂蛋白比率等临床指标相关,提示CIRBP和TREM-1可能共同参与COPD的发生发展。

大黄鱼冷诱导结合蛋白(CIRP)基因cDNA克隆及低温胁迫对其时空表达的影响

为研究冷诱导结合蛋白(CIRP)在大黄鱼低温适应过程中的作用,采用同源克隆技术获得了大黄鱼CIRP基因,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了低温胁迫下大黄鱼各组织中CIRP基因的表达变化。结果显示,大黄鱼CIRP基因cDNA序列全长1211 bp,推测编码一个由182个氨基酸组成、分子量为19 ku的蛋白。序列比对显示硬骨鱼类CIRP基因序列较为保守,特别是N端的RNA识别基序(RRM)高度保守。系统进化树分析显示大黄鱼CIRP与银鳕相似性最高(81.5%),所有硬骨鱼类聚为一个大支。慢性低温胁迫中(12℃缓降至6℃),皮肤和肌肉中CIRP基因的表达量呈随温度降低而升高的趋势,6℃时表达量分别为12℃时的11.56倍和9.03倍;鳃、脑和心脏中CIRP基因表达量均呈先显著上升后显著下降的趋势,其峰值均出现在8℃时,表达量分别为12℃时的5.07、7.69和2.83倍;肠、肾脏、肝脏和脾脏中的表达量随温度降低而下降,6℃时的表达量最低,与12℃时相比降幅分别为80.0%、65.6%、91.2%、55.6%。急性低温胁迫(由12℃骤降至8℃并胁迫4 h)条件下,鳃、皮肤、脑、肝脏、心脏中CIRP基因表达量均呈先升高后降低的变化,反映了机体对低温胁迫的应激、适应过程;肌肉和肠中的表达量则始终显著低于胁迫前。慢性和急性低温胁迫中各组织CIRP表达量变化的差异提示,大黄鱼机体在低温胁迫响应和适应中有着多种调节机制。研究表明,CIRP基因参与了大黄鱼应对低温胁迫的过程。

TREM-1与CIRP在胃癌组织中的表达及其对胃癌预后的评估价值

目的探讨髓样细胞触发受体-1(TREM-1)与冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)在胃癌组织中的表达及其对胃癌预后的评估价值。方法选取2016年9月至2019年9月该院收治的108例胃癌患者作为研究对象,收集胃癌患者的癌组织标本作为胃癌组,对应的癌旁组织标本作为癌旁组。采用免疫组织化学法检测胃癌组及癌旁组TREM-1、CIRP表达情况;采用χ^(2)检验比较不同临床病理特征胃癌患者TREM-1、CIRP表达情况;采用多因素Cox回归分析胃癌患者预后的危险因素。结果胃癌组TREM-1阳性表达率(78.70%)高于癌旁组(37.96%),差异有统计学意义(χ^(2)=36.876,P<0.05);胃癌组CIRP阳性表达率(73.15%)高于癌旁组(43.52%),差异有统计学意义(χ^(2)=19.505,P<0.05)。低分化、肿瘤最大径>5 cm、临床分期为Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴结转移的胃癌患者TREM-1、CIRP阳性表达率均高于中/高分化、肿瘤最大径≤5 cm、临床分期为Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴结转移的胃癌患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。TREM-1阳性表达患者3年生存率为41.18%,低于TREM-1阴性表达患者的91.30%,差异有统计学意义(P<0.05);CIRP阳性表达患者3年生存率为36.71%,低于CIRP阴性表达患者的93.10%,差异有统计学意义(P<0.05)。低分化、临床分期为Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴结转移的胃癌患者3年生存率均低于中/高分化、临床分期为Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴结转移的胃癌患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素Cox回归分析结果显示,临床分期为Ⅲ~Ⅳ期(HR=2.425,95%CI:1.591~3.697)、有淋巴结转移(HR=2.646,95%CI:1.709~4.096)、TREM-1阳性表达(HR=3.343,95%CI:2.081~5.373)、CIRP阳性表达(HR=2.898,95%CI:1.843~4.557)是胃癌患者生存的危险因素(P<0.05)。结论TREM-1、CIRP在胃癌患者中均呈高表达,且与患者临床病理特征及预后密切相关,能够作为胃癌预后评估的生物学标志物,有望为胃癌提供新的治疗靶点。

不同强度冷刺激对大鼠心脏、大脑、睾丸和肺脏中CIRP表达的影响

采用Western blot和实时荧光定量RT-PCR方法,研究不同强度不同时间冷刺激后大鼠心脏、大脑、睾丸和肺脏中冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)的表达情况.结果表明:常温(20℃±1℃)下大鼠4种组织中均存在一定的CIRP的表达;急性冷刺激组(-10℃±1℃、-4℃±1℃、0℃±1℃、4℃±1℃)心脏、大脑和睾丸中CIRP mRNA表达在冷刺激0～6 h呈上升趋势,6 h时达到最高值,随后呈下降趋势,肺脏中CIRP mRNA表达在0～6 h呈下降趋势,在6 h时达到最低值,随后呈上升趋势;慢性冷应激组(10℃±1℃)大鼠心脏、大脑和睾丸3种组织中CIRP mRNA在不同时间点(1周、2周、3 W周)的表达均高于正常对照组(P>0.05),肺脏CIRP mRNA表达均低于对照组(P>0.05),并且同一组织不同时间点之间差异不显著(P>0.05).可见冷刺激后CIRP的表达存在一定规律并且表现出组织特异性,可能与组织保护特异性有关.

BALB/C鼠冷诱导RNA结合蛋白的原核表达、纯化及其单克隆抗体的制备

为了获得冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)的单克隆抗体,通过RT-PCR方法从冷处理BALB/C小鼠睾丸的总RNA中扩增获得CIRP基因序列,克隆至pGEM-T载体,获得重组质粒pGEM-CIRP,并进行序列测定。将测序正确的CIRP序列插入质粒pQE-30-Xa,构建表达载体pQE-30-CIRP并转化E.coliM15,IPTG诱导后SDS-PAGE分析表明CIRP基因在大肠杆菌中获得高效表达,可溶性分析表明CIRP融合蛋白以包涵体形式表达。采用Ni-NTA亲和层析、电洗脱纯化融合蛋白CIRP,将纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠,三次免疫后,间接ELISA测定小鼠效价,效价为1:105,采用杂交瘤技术融合,用间接ELISA法、有限稀释法筛选阳性杂交瘤细胞,通过Western blot对McAb特异性进行鉴定,利用间接ELISA方法对McAb的Ig亚类(型)、杂交瘤细胞上清、腹水效价进行测定。结果获得了1A6、2D3、3C5及4C44株稳定分泌CIRPMcAb的杂交瘤细胞株,1A6、3C5、4C4产生的单克隆抗体亚类均为IgG2b,2D3产生的单抗亚类为IgG3,轻链均属κ链。4株单克隆细胞上清效价均在1:103以上,腹水效价均达1:107以上。Westernblot分析4株单抗均能与重组蛋白CIRP特异性结合,与空载体对照没有反应。以3C5细胞株的腹水为一抗,检测冷应激小鼠多种组织中天然CIRP蛋白表达,结果显示3C5细胞腹水能识别心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸等多种组织中天然CIRP,并与能之与结合。这证明该抗体具有良好特异性和结合活性,制备的单克隆抗体可以用于深入开展CIRP的功能性和应用性研究。

上调CIRBP基因表达抑制肾癌细胞的增殖和迁移及其可能的分子机制

目的:探讨冷诱导RNA结合蛋白(cold inducible RNA binding protein,CIRBP)基因在肾癌中的生物学功能。方法:用GEO(Gene Expression Omnibus)和癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库的基因芯片和基因测序数据分析肾癌中CIRBP mRNA的表达水平。实时荧光定量PCR法验证CIRBP基因在20例肾癌组织及3种肾癌细胞株中的表达水平。将CIRBP过表达质粒分别转入至肾癌786-O和CAKI-1细胞,随后采用MTT法和细胞克隆形成实验检测肾癌细胞的增殖活性,并采用Transwell小室实验检测肾癌细胞的迁移能力,最后采用蛋白质印迹法检测细胞迁移相关蛋白N-钙黏蛋白(N-cadherin)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)以及蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称AKT)通路相关蛋白的表达水平。结果:肾癌组织中CIRBP mRNA的表达水平明显低于癌旁正常组织。高表达CIRBP肾癌患者的预后明显优于CIRBP低表达者。CIRBP过表达质粒转染后,肾癌786-O和CAKI-1细胞的增殖活性和克隆形成能力明显受到抑制(P值均<0.01),穿过Transwell小室膜的细胞数明显少于对照组(P值均<0.01)。而且CIRBP基因过表达后,肾癌细胞中迁移相关蛋白N-cadherin表达明显降低,E-cadherin水平明显增高,而AKT通路关键蛋白磷酸化AKT(phospho-AKT,p-AKT)和磷酸化糖原合酶激酶3β(phospho-glycogen synthasc kinase 3β,p-GSK3β)的表达水平明显下调(P值均<0.05)。结论:CIRBP在肾癌组织中表达下调,CIRBP过表达可抑制肾癌细胞的增殖和迁移,提示其可以作为一种肾癌的潜在临床诊治靶点及预后标志物。

冷诱导RNA结合蛋白在放射性肺损伤模型中的表达变化

目的探讨冷诱导RNA结合蛋白(CIRBP)在放射性肺损伤模型中的表达变化。方法将30只雄性C57BL/6小鼠按体重随机分为2组,每组15只,对照组小鼠不做任何处理,模型组小鼠经20 Gy X射线单次胸部照射,构建放射性肺损伤模型,于照射后5周解剖。采用苏木素-伊红(H&E)染色和Masson染色观察肺组织病理改变及胶原的沉积;采用免疫组织化学法检测肺组织炎症因子白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达;采用qRT-PCR技术检测肺组织中CIRBP mRNA的表达;采用免疫荧光技术和Western blotting技术检测肺组织中CIRBP蛋白的表达。结果与对照组相比,模型组肺组织血管扩张充血、炎细胞浸润、部分肺泡间隔增厚,IL-6的表达[(187.22±34.77) vs (129.41±5.58),t=3.179,P <0.05]和TNF-α的表达[(187.02±19.16)vs (137.52±23.53),t=5.069,P <0.05]均升高,差异具有统计学意义,而且模型组肺组织中CIRBP mRNA的表达明显升高[(1.97±0.39) vs (1±0.08),t=3.45,P <0.05]。除此之外,免疫荧光和Western blot结果显示模型组CIRBP蛋白表达均明显升高[(14.76±1.61) vs (9.32±1.26),t=3.751,P <0.05;(1.49±0.14) vs (1.13±0.17),t=2.819,P <0.05],差异具有统计学意义。结论 CIRBP在放射性肺损伤模型中的表达明显升高,其可能是放射性肺损伤过程中的重要促炎因子。