C57BL/6小鼠CIA模型的建立及其监测体系的初步筛选

目的 建立稳定的C5 7BL/ 6小鼠胶原诱导关节炎 (CIA)模型 ,构建进一步进行类风湿关节炎 (RA)发病机制及治疗研究的体系。方法 取 4 0只雄性C5 7BL/ 6小鼠 ,随机分为模型组和对照组。模型组采用鸡II型胶原与完全弗氏佐剂在尾部皮内注射 ,2 1天后同样方法加强免疫。定期观察两组小鼠的关节和关节外表现以及病理学改变 ;用三重免疫荧光标记、胞内细胞因子测定流式细胞术检测外周血T细胞亚群。结果 对照组小鼠均未发病。模型组小鼠在 5 0天的发病率达 70 % ,关节炎评分在 3～ 8分 ,持续时间大约 1 0 0天 ;病理切片显示典型的炎性细胞浸润 ,滑膜增生 ,软骨及软骨下骨破坏 ;外周血Th1 /Th2比值升高。结论 应用Ⅱ型胶原能在C5 7BL/ 6小鼠上成功建立CIA模型 。

TRAIL对CIA小鼠脾细胞表达Th1/Th2细胞因子的影响

目的观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对胶原诱导型关节炎(CIA)小鼠的治疗效果,探讨TRAIL治疗类风湿性关节炎(RA)的可能机制。方法牛Ⅱ型胶原蛋白加弗氏完全佐剂免疫DBA/1J小鼠建立CIA模型,采用重组腺相关病毒AAV-TRAIL关节腔内注射进行治疗。CBA和流式细胞术检测Th1/Th2细胞因子的分泌。结果 AAV-TRAIL可改善CIA小鼠的病情,减轻关节红肿。体外研究其机制发现Ⅱ型胶原可以增加Th1型细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2和Th2型细胞因子IL-4、IL-5的分泌,其中Th1型细胞因子的增加更为明显。而TRAIL则可显著抑制Ⅱ型胶原引起的Th1型细胞因子的上调,而对Th2型细胞因子的分泌没有影响。结论 TRAIL对CIA小鼠的治疗作用可能和TRAIL抑制Th1型细胞因子分泌相关。

薯蓣皂苷对胶原诱导型关节炎小鼠RORγt、Foxp3的影响

目的探讨薯蓣皂苷对胶原诱导型关节炎小鼠的治疗作用及其机制。方法选用DBA1/J小鼠建立鸡Ⅱ型胶原诱导型关节炎小鼠模型(CIA),将造模成功的小鼠采用随机数字表法分为CIA模型组、薯蓣皂苷组、雷公藤多苷组,另设正常对照组,药物组于初次免疫后第21天开始灌胃给药,对照组和模型组给相同体积溶媒。初次免疫第35天处死小鼠,无菌取腹股沟淋巴结制成单细胞悬液,用实时荧光定量PCR技术检测Th17、Treg细胞特异性转录因子RORγt、Foxp3的表达情况。结果模型组与对照组相比,RORγt显著升高(P<0.05);2药物组与模型组相比RORγt显著下降(P<0.05);与模型组相比,薯蓣皂苷组Foxp3显著升高(P<0.05)。结论薯蓣皂苷可以调节Th17、Treg细胞特异转录因子RORγt、Foxp3的平衡。

槲皮素对小鼠胶原诱导性关节炎症的影响

目的探讨槲皮素对Ⅱ型胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠关节炎症的影响。方法 6-7周龄的DBA/1 J小鼠随机分为4组,每组10只,对照组,模型组,甲氨喋呤组,槲皮素组。除对照组外,其余小鼠给予牛属Ⅱ型胶原+完全弗氏佐剂进行CIA小鼠第一次免疫,第21天给予牛属Ⅱ型胶原+不完全弗氏佐剂进行加强免疫,次日各组开始给药30天,观察小鼠体重、关节炎指数、足掌厚度、关节病理变化指标。结果与模型组相比,槲皮素可显著改善CIA小鼠关节炎指数、足掌肿胀,对CIA小鼠体重无明显影响,可显著改善CIA小鼠踝关节的病理表现,减轻踝关节的骨破坏。结论槲皮素可有效的减轻CIA小鼠关节滑膜炎症,减轻关节骨破坏,槲皮素是治疗类风湿性关节炎的潜在有效药物。

沉默转录因子YY1表达对胶原诱导的关节炎小鼠肠道菌群的影响

目的:通过干扰慢病毒探讨沉默转录因子阴阳1(YY1)表达对胶原诱导关节炎(CIA)小鼠肠道菌群的影响。方法:采用Ⅱ型胶原免疫DBA/1J小鼠构建CIA模型;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-17 mRNA相对表达量;采用16S rRNA高通量测序方法进行肠道微生物测序,测序结果采用Microbial Ecology相关软件和数据库进行分析。结果:与对照组(NC)相比,在CIA小鼠体内干扰YY1表达后,小鼠的关节炎症评分降低,外周血单个核细胞中TNF-α、IFN-γ和IL-6 mRNA相对表达量降低;反映菌群分布丰度的ACE和Chao指数无明显差异;反映菌群多样性的Shannon指数增加,Simpson指数降低;Intestinimonas和Acetobacteroides菌属含量增加;京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析显示磷酸代谢和丙二酚降解等功能有差异。结论:在CIA小鼠体内沉默YY1表达可影响其肠道菌群的多样性和分布。

胶原诱导性关节炎小鼠脾脏树突状细胞的检测及意义

目的:观察胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠病程中脾脏树突状细胞(DC)亚群的比例及变化规律。方法:将6~8周龄近交系雄性DBA/l小鼠12只分为对照组(n=6)和模型组(n=6),模型组小鼠参照经典的CIA模型方法制备CIA模型,正常组小鼠同剂量尾根部注射0.9%氯化钠溶液;观察两组小鼠关节情况,用关节炎指数(AI)评分衡量关节病变情况,采用HE染色观察关节的组织形态学改变,通过流式细胞术检测脾经典DC(cDC)及CD8^+cDC、CD4^+CD8^-cDC、CD4^-CD8^-DC各亚群的变化。结果:与对照组比较,模型组小鼠出现明显的关节红肿、行动迟缓等表现,HE染色显示模型组小鼠踝关节结构被破坏,关节软骨可见明显坏死脱落、纤维化,并有大量炎细胞浸润,且AI评分高于对照组(P<0.05),脾脏cDC及CD4^+CD8^-cDC比例降低(P<0.05),CD4^-CD8^-cDC比例升高(P<0.05)。结论:CIA小鼠脾脏DC细胞亚群的变化可能与RA病情的进展有关。

GSK-3β抑制剂对类风湿性关节炎小鼠脾脏树突状细胞亚群的影响

目的:观察糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)抑制剂对胶原诱导的关节炎(CIA)小鼠的治疗作用及其与树突状细胞(DC)亚群变化的相关性。方法:取6~8周龄近交系雄性DBA/l小鼠19只,分为正常组(n=5)、模型组(n=7)及治疗组(n=7),模型组与治疗组小鼠制作CIA模型,治疗组小鼠于造模后第22天开始每天予GSK-3β抑制剂(TDZD-8)5 mg/kg,模型组与正常组均予等量生理盐水,连续注射2周;观察和比较各组小鼠足趾肿胀程度及关节炎指数(AI)评分;第46天脱颈处死各组小鼠后切取右后肢踝关节,采用苏木素-伊红(HE)染色观察各组小鼠关节的组织学特征;采用免疫组织化学检测各组小鼠关节滑膜组织GSK-3β表达,采用流式细胞术检测各组小鼠脾脏树突状细胞(DC)中淋巴组织驻留型DC(cDC)及其CD8^+cDC、CD4^+CD8^-cDC、CD4^-CD8^-cDC各亚群变化。结果:与模型组比较,治疗组小鼠踝关节处红肿、出血点等现象明显好转;与模型组相比,治疗组小鼠AI评分在初次免疫后第33天开始下降,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);HE染色结果显示为关节腔炎症状态明显改善;治疗组小鼠踝关节GSK-3β蛋白表达低于模型组,高于正常组,差异均有统计学意义(P<0.05);治疗组小鼠脾脏总cDC、CD4^+cDC比例高于模型组,低于正常组,差异均有统计学意义(P<0.05);治疗组小鼠脾脏CD4^-CD8c^-cDC比例低于模型组,高于正常组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:GSK-3β抑制剂可通过调节CIA小鼠脾脏cDC数量及各亚群的比例,缓解其关节病变及其病理表现。

断藤益母汤对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞MEKK2及CIA小鼠关节炎的影响

目的:为了研究断藤益母汤(DTYMD)在类风湿关节炎中对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)上游激酶的调控作用,阐明DTYMD抗炎的分子机制。方法:培养成纤维样滑膜细胞,将细胞分为空白组,模型组,DTYMD高、中、低质量浓度组(1000,800,600 mg·L^-1),甲氨蝶呤(MTX)组(20μmol·L^-1)组,采用蛋白免疫印迹法(Western blot),实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)对丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶2(MEKK2)的蛋白和mRNA表达进行分析。将42只雄性DBA/1J小鼠随机分为6组,每组7只,分别为正常组,模型组,MTX组(2 mg·kg-1),DTYMD低、中、高剂量组(6.25,12.5,25 mg·kg-1)。除正常组外,其他5组均采用二次免疫法构建胶原诱导型关节炎(CIA)模型。给药结束后,取小鼠后肢踝关节行苏木素-伊红(HE)染色并进行关节病理评分。结果:与模型组比较,DTYMD以浓度依赖方式抑制成纤维样滑膜细胞活性(P<0.01);与空白组比较,模型组细胞增殖率升高(P<0.01)。与模型组比较,DTYMD高、中质量浓度组降低MEKK2蛋白及mRNA的表达(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,DTYMD不同剂量组均降低细胞基质金属蛋白酶-1(MMP-1),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-6(IL-6)的表达(P<0.01);与空白组比较,模型组MMP-1,IL-6,TNF-α表达明显上升(P<0.05,P<0.01)。在动物实验中,与模型组比较,DTYMD高、中剂量组可以降低CIA小鼠关节肿胀度(P<0.05,P<0.01);与正常组比较,模型组小鼠二次免疫后关节明显肿胀(P<0.05)。在CIA小鼠踝关节HE染色中,与空白组比较,模型组小鼠病理学评分升高(P<0.01);与模型组比较,DTYMD高、中剂量小鼠关节病理评分明显下降(P<0.05,P<0.01)。结论:DTYMD可能通过下调MEKK2对细胞因子IL-6,TNF-α,MMP-1负性调控,从而缓解类风湿关节炎的炎症反应。

冰水潮湿诱发的脾虚对DBA/1小鼠胶原诱导型关节炎的影响及参苓白术散的“以方测证”

目的:探究冰水潮湿诱发的脾虚证对胶原诱导型关节炎(CIA)病情的影响。方法:首先予饮用冰水和潮湿环境[湿度(80±5)%]诱发DBA/1小鼠脾虚证,再采用牛源性Ⅱ型胶原建立CIA模型,后予以参苓白术散颗粒治疗,比较不同处理下各组DBA/1小鼠的脾虚证及关节炎病情差异。结果:DBA/1小鼠饮用冰水和处于潮湿环境30 d后,血清α淀粉酶、胃泌素和胰蛋白酶较空白对照组显著下降(P<0.01,P<0.05),表明小鼠出现脾虚证;与CIA模型组小鼠比较,冰水潮湿组小鼠体内血清IL-6、G-CSF和关节炎症评分(第65天)上调(P<0.05);参苓白术散治疗后,与冰水潮湿组比较,可上调α淀粉酶和胃泌素(P<0.05),缓解关节炎症状及下调血清anti-CⅡ抗体、G-CSF和IL-6水平(P<0.05,P<0.01)。结论:饮用冰水和外部潮湿环境可成功诱发小鼠脾虚证,且脾虚证加重CIA小鼠关节炎病情,参苓白术散可缓解脾虚证CIA小鼠关节炎症状。