LoVo细胞系中结肠癌干细胞样细胞的分离、培养及鉴定

目的:从结肠癌LoVo细胞系中分离、鉴定具有CD44+/EPCAMhigh特异表型的结肠癌干细胞样细胞,观察其生物学行为,证实该细胞系中结肠癌干细胞样细胞的存在。方法:从普通血清培养的LoVo细胞系中以流式细胞仪分选具有CD44+/EPCAMhigh表型的细胞,接种于添加生长因子的无血清培养基中,观察其增殖过程,继而诱导分化。MTT法、流式细胞术检测CD44+/EPCAMhigh、EPCAMlow和未分选LoVo细胞的增殖能力及细胞周期分布。3种细胞接种裸鼠,比较不同细胞的成瘤率;免疫荧光技术检测小鼠次代CD44+/EPCAMhigh细胞中CD44/EPCAM的表达。结果:LoVo细胞中有17.4%的CD44+/EPCAMhigh细胞,并能在添加生长因子的无血清培养基中呈细胞球样生长,且可连续传代;在血清的诱导下,呈贴壁分化生长,其形态与未分选LoVo细胞无差别。CD44+/EPCAMhigh细胞增殖能力高于EPCAMlow细胞及未分选LoVo细胞,且细胞周期多集中在G0/G1期。以500个CD44+/EPCAMhigh细胞接种裸鼠成瘤率为90%(9/10),而1×104个EPCAMlow细胞成瘤率为0(0/10)。小鼠移植瘤中次代CD44+/EPCAMhigh细胞仍能少量表达CD44和EPCAM。结论:LoVo细胞中存在CD44+/EPCAMhigh结肠癌干细胞样细胞,CD44+/EPCAMhigh可用于结肠癌肿瘤干细胞的深入研究。

反义DLC-1基因对结直肠癌LoVo细胞增殖和细胞周期的影响

目的应用核糖核酸干扰(RNAi)技术,通过对大肠癌细胞株LoVo中DLC-1基因mRNA表达的抑制,初步探讨DLC-1基因对大肠癌细胞株的生物学行为影响。方法构建DCL-1的RNAi重组体pGCsiDLC,转染大肠癌LoVo细胞株。采用RT-PCR观察转染前后细胞株中DLC-1 mRNA以及Bax、Bcl-2基因表达的改变,MTT比色法检测转染前后细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期。结果成功构建发卡siRNA真核表达载体pGCsiDLC;pGCsiDLC转染LoVo细胞后,电泳显示DLC-1 mRNA表达水平明显下降;LoVo细胞生长曲线增长幅度亦随时间的增加而逐渐增高,在48h最为明显,RNAi组细胞比脂质体组及空白对照组细胞增殖明显增高(P<0.05);干扰后的LoVo细胞株G0/G1期发生阻滞,而G2/M期细胞数量分布减少。而Bax和bcl-2基因表达在干扰前后未见明显改变。结论成功构建载体介导的DLC-1靶向RNAi重组体可有效抑制LoVo细胞DLC-1 mRNA表达;DLC-1基因可抑制结直肠癌细胞增殖并且对细胞周期重新分布,其可能与结直肠癌的发生发展有一定关系,可能是一个新的抑癌基因。

大黄素通过ROS介导大肠癌细胞株LOVO凋亡的实验研究

目的观察大黄素对人大肠癌细胞株LOVO凋亡的影响,并探讨活性氧(ROS)是否介导了大黄素诱导细胞凋亡的过程。方法体外分组培养人大肠癌细胞株LOVO,设空白对照组和大黄素3个不同浓度干预组(40,80,120μmol.L-)1,大黄素干预时间分别为12,24,48 h。以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖率、AnnexinⅤ-FITC和PI双染流式细胞术检测凋亡,激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内ROS水平,Western印迹法检测caspase-3表达。结果与空白对照组比较,大黄素干预组呈浓度依赖性诱导大肠癌细胞株LOVO凋亡,细胞内ROS水平明显增加,caspase-3的表达明显上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论大黄素通过ROS介导线粒体凋亡信号通路诱导大肠癌细胞凋亡,可能是大肠癌细胞凋亡诱导途径之一。

大肠癌细胞系Lovo中亚群(SP)细胞的分离培养和鉴定

目的:应用无血清培养液(SFM)培养Lovo细胞系,克隆分离具有干细胞样特性SP细胞.方法:应用SFM培养Lovo细胞,分离成球样生长的细胞群作为SP细胞,并通过有限稀释,分化,自我更新,含血清培养基(SSM)和SFM交替培养及Musashi-1化学染色方法来鉴定SP细胞.结果:Lovo细胞中约含有0.54%-0.62%的SP能够在无血清培养基中能够存活、增殖,形成悬浮的肿瘤细胞球;在SFM中加入血清可促使SP细胞分化;SP细胞可以连续传代,并可交替培养于SSM和SFM中,细胞形态无明显变化;SP细胞Musashi-1染色阳性.结论:应用SFM可从Lovo细胞中分离出极少量的具有干细胞特性的SP细胞.

结肠癌耐药细胞株LoVo/5-Fu中microRNA表达的初步研究

目的建立结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU并初步筛选可能的耐药相关的microRNA。方法采用5-FU浓度递增法建立人结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU,观察其生长规律并绘制细胞生长曲线;用MTT法鉴定耐药细胞株耐药性并计算耐药指数(RI);用microRNA芯片技术检测耐药细胞株LoVo/5-FU与其亲本细胞株LoVo中mi-croRNA的表达谱,筛选差异表达的microRNA;用实时荧光定量PCR方法对筛选出的部分差异microRNA在耐药细胞及其亲本细胞中的表达情况进行验证。结果 LoVo/5-FU细胞与LoVo细胞相比,生长缓慢,细胞体积增大,耐药株LoVo/5-FU细胞相对于其亲本LoVo细胞的耐药倍数为8.08。microRNA芯片的结果显示,耐药株LoVo/5-FU细胞与亲本LoVo细胞比较,有10个microRNA表达上调,13个microRNA表达下调;实时荧光定量pcr的结果进一步证实mir-210、mir196a、mir-1281在LoVo/5-FU中显著上调,而let-7f、mir-1228显著下调,其中mir-210在LoVo/5-FU与LoVo中的表达有明显差异。结论 LoVo/5-FU细胞株耐药性稳定,筛选获得的差异miRNA可能通过调控其靶基因而参与人结肠癌细胞对5-Fu的耐药,为进一步研究microRNA在结肠癌耐药机制中的作用奠定基础。

CEA-rv诱导特异性CIK细胞对Lovo细胞株杀伤作用的研究

目的探讨癌胚抗原重组基因痘苗(CEA-rv)负荷脐血来源树突状细胞(DCs)诱导特异性CIK细胞对结肠癌细胞株Lovo杀伤活性的影响作用。方法取制备好的CEA-rv,用脐血单个核细胞(CBMC)分别制备DCs和CIK细胞;用负荷CEA-rv的DCs和CIK细胞共培养,诱导CEA-rv-DC-CIK细胞。用流式细胞术检测DC免疫表型,MTT法检测CBMC、CIK、Ag-CIK、Ag-DC-CIK和CEA-rv-DC-CIK对Lovo肿瘤细胞株的杀伤活性。结果脐血DCs高表达CD86、CD40,中度表达CD83和CD80。实验组细胞(CEA-rv-DC-CIK)对Lovo细胞的杀伤能力(62%)明显高于对照组(P<0.01)。结论 CEA-rv负荷的DCs能增强CIK细胞对Lovo细胞的杀伤活性,为CEA阳性肿瘤的免疫治疗提供了新的思路。

苹果酸舒尼替尼对人结肠癌细胞株LoVo的增殖抑制作用

目的探讨苹果酸舒尼替尼体外对结肠癌LoVo细胞的生长抑制及诱导凋亡的作用。方法利用四亚基噻唑蓝(MTT)法和台盼蓝拒染法观察苹果酸舒尼替尼对结肠癌LoVo细胞生长抑制作用。应用流式细胞仪、电子显微镜检测苹果酸舒尼替尼诱导LoVo细胞的凋亡作用。结果 MTT结果显示苹果酸舒尼替尼在(2.5～20μM)的浓度范围内对结肠癌LoVo细胞的生长具有显著的抑制作用。生长曲线结果显示各个浓度的药物对LoVo细胞的抑制作用呈时间依赖性。流式细胞仪可以观察到细胞周期阻滞在G0/G1期。透射电子显微镜下见到典型的早期凋亡形态学表现。结论在一定的浓度范围内,苹果酸舒尼替尼可以抑制LoVo细胞的生长,并呈剂量和时间依赖效应。其抗肿瘤的特性与引起肿瘤细胞的凋亡有关。

人结肠癌紫杉醇耐药细胞株的建立及耐药相关基因mRNA表达的研究

目的建立紫杉醇耐药细胞株LoVo/Taxol,探讨结肠癌细胞紫杉醇获得性耐药的可能机制。方法反复用紫杉醇处理结肠癌LoVo细胞,诱导建立结肠癌紫杉醇耐药细胞株LoVo/Taxol;通过MTT法检测细胞药物敏感性,光学显微镜和透射电镜观察细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡水平,实时荧光定量PCR法测定细胞中多药耐药基因MDR1、MRP1、LRP、GST-π和TopoⅡ的表达。结果建立的紫杉醇耐药细胞株LoVo/Taxol对紫杉醇的耐药指数为42,为高度耐药;对阿霉素及5-氟脲嘧啶也产生强烈的交叉耐药,耐药指数分别为796和187。相较于亲本细胞LoVo,LoVo/Taxol细胞形态发生明显的变化,G2/M期阻滞和细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。在五种经典的耐药相关蛋白中MRP1、MDR1基因m RNA的转录水平分别提高了37倍和2倍,LRP、GST-π基因m RNA的转录水平分别下降了11倍和3倍(P均<0.05),To Po II基因转录水平无明显变化。结论成功建立的人结肠癌紫杉醇耐药细胞株LoVo/Taxol为典型的多药耐药细胞模型,其耐药机制可能与MRP1基因的过表达有关。

扶正抑癌方含药血清对结肠癌lovo细胞E-cad、N-cad和Snail蛋白表达的影响

[目的]通过观察扶正抑癌方含药血清对结肠癌lovo细胞E-cad、N-cad和Snail蛋白表达的影响,探讨扶正抑癌方对结肠癌细胞EMT的影响,从而进一步明确扶正抑癌方抑制结肠癌转移的机制。[方法]lovo细胞体外培养,制备大鼠不同浓度含药血清后,MTT法测定不同浓度含药血清对细胞增殖的影响;免疫荧光法检测E-cad、N-cad的表达,Western Blot检测Snail蛋白的表达。[结果]高剂量含药血清组24h对lovo细胞抑制率较中剂量、低剂量组更加明显,差异具有统计学意义(P<0.01),免疫荧光结果显示扶正抑癌方含药血清可以下调lovo细胞N-cad的表达和上调E-cad表达,与正常组和空白组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);Western Blot检测结果显示扶正抑癌方含药血清能降低lovo细胞转录因子Snail蛋白的表达,与正常组和空白组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。[结论]扶正抑癌方含药血清通过上调E-cad表达和下调N-cad的表达,抑制lovo细胞的EMT转变,从而降低lovo细胞的侵袭力和运动能力。

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂ZD1839与伊利替康联合效应的实验研究

目的探讨ZD1839与伊利替康的活性代谢产物7-乙基-10羟基-喜树碱(SN38)联合的最佳方案及其机制。方法以药物联合效应测定方法,评价ZD1839和SN38不同给药顺序对人结肠癌细胞HT-29和LoVo的抑制作用;以Western blot和免疫共沉淀方法,分析ZD1839与化疗不同联合方案对各自靶蛋白及其下游分子表达的影响;以流式细胞仪测定不同联合方案对细胞周期的影响;以组蛋白相关的DNA碎片分析,比较不同方案对细胞凋亡指数的影响。结果先SN38后ZD1839的序贯给药方案表现出明显的协同作用;反之,则表现为拮抗作用。SN38明显抑制细胞拓扑异构酶-I (Topo-I)活性;ZD1839不影响表皮生长因子受体(EGFR)的表达,但能抑制EGFR的磷酸化。与SN38单药相比,SN38联合ZD1839对Topo-I的抑制无增强;与单药ZD1839相比,联合方案对EGFR、MAPK磷酸化的抑制作用无增强,但ZD1839、SN38同时给药,和先SN38后ZD1839序贯给药对AKT的抑制有所增强。同时,联合方案对细胞周期分布的改变影响明显。ZD1839可明显维持化疗诱导的DNA损伤和细胞凋亡。结论先SN38后ZD1839序贯给药可能是治疗结肠癌的最佳联合模式。

可利霉素体外抗结肠癌活性的研究

目的:评价可利霉素(carrimycin, CAM)及其单组分异戊酰螺旋霉素Ⅰ(isovalerylspiramycinⅠ, ISPⅠ)对结肠癌细胞的抑制作用,初步探讨其抗肿瘤的作用机制。方法:选择结肠癌细胞系LoVo,评价CAM及其单组分ISPⅠ与螺旋霉素(spiramycin, SP)及其单组分螺旋霉素Ⅰ(spiramycinⅠ, SPⅠ)的抗肿瘤活性,采用CCK-8试剂盒检测对细胞增殖的影响;采用克隆形成实验分析对细胞克隆形成能力的影响;采用流式细胞术分析对细胞凋亡的影响;采用划痕实验检测对细胞迁移能力的影响。通过转录组分析CAM、ISPⅠ发挥抗肿瘤活性可能作用的信号通路。结果:CAM及其单组分ISPⅠ可以有效抑制结肠癌细胞的增殖、克隆形成,能促使细胞凋亡比例增加,但对细胞迁移能力影响不明显;在给药6 h和9 h后,CAM及其单组分ISPⅠ在细胞内的相对含量高于SP及其单组分SPⅠ;转录组测序分析发现CAM及ISPⅠ可能作用于细胞粘附相关信号通路和PI3K/Akt信号通路。结论:CAM及其单组分ISPⅠ具有体外抗结肠癌活性,且优于SP及其单组分SPⅠ,这可能与其更好的细胞穿透性相关,CAM及ISPⅠ的抗结肠癌活性可能是通过作用于细胞粘附相关信号通路和PI3K/Akt信号通路而发挥的,这为进一步研究CAM及其单组分的抗肿瘤作用机制奠定了基础。

WTX基因对结肠癌细胞增殖和凋亡的作用

目的 WTX基因转染结肠癌Lovo细胞株,分析WTX基因对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响。方法将结肠癌Lovo细胞株分为WTX基因转染组和对照组,WTX基因转染组给予WTX质粒转染,对照组给予空载质粒转染。观察WTX基因转染组和对照组WTX基因的表达情况,两组Lovo细胞株结肠癌细胞的增殖情况、凋亡情况及细胞周期变化。结果 WTX基因转染组结肠癌细胞WTX蛋白表达明显高于对照组(P<0.05);WTX基因转染组结肠癌转染后4、7d光密度值均明显低于对照组(P<0.05);WTX基因转染组G1期细胞比例明显高于对照组(P<0.05),WTX基因转染组G2期和S期细胞比例明显低于对照组(P<0.05)。结论 WTX基因抑制结肠癌细胞的增殖,影响结肠癌细胞周期,对结肠癌细胞凋亡没有影响。